活細胞內(nèi)篩選地塞米松衍生物作用靶蛋白的研究.pdf

1、第一部分糖皮質激素受體結合域誘餌表達載體的構建和鑒定 目的:構建糖皮質激素受體α配體結合域(GRα-LBD)的誘餌表達載體，為小分子配體酵母三雜交系統(tǒng)的建立奠定基礎。 方法 RT-PCR擴增K562細胞的GRα-LBD，克隆入誘餌載體pGBKT7中，測序正確后，再把構建好的誘餌載體pGBKT7-GRα-LBD轉化到酵母AH109細胞中，提取酵母蛋白，并用Western blot分析誘餌蛋白的表達情況。同時檢測誘餌蛋白的毒

2、性、滲漏和自激活作用。 結果:成功擴增了GRα-LBD，并分別成功克隆到pGBKT7中，測序結果正確。誘餌載體成功轉化到酵母AH109細胞中，無毒性、滲漏和自激活作用，Western blot分析也證實了酵母細胞表達誘餌蛋白。 結論:成功構建了GRα-LBD酵母誘餌表達載體，為建立小分子配體酵母三雜交系統(tǒng)奠定了基礎。 第二部分人K562細胞cDNA文庫的擴增、純化、鑒定和酵母細胞轉化 目的:對預轉化到大腸

3、DH5α中的人K562細胞cDNA文庫進行擴增，純化和鑒定并將文庫質粒轉化酵母為下一步的靶蛋白的篩選做準備。 方法:對K562細胞cDNA文庫進行擴增，提取文庫質粒，將文庫質粒轉化酵母Y187細胞，并用PCR和酶切鑒定轉化結果。 結果:成功的擴增人K562細胞cDNA文庫，并驗證了文庫的多樣性，將文庫質粒成功轉化酵母Y187細胞。 結論: K562細胞cDNA文庫的成功擴增，純化，鑒定，為進一步的文庫篩選奠定了基

4、礎。 第三部分酵母三雜交技術篩選地塞米松衍生物作用的靶蛋白 目的:通過酵母三雜交技術在人K562細胞cDNA中篩選地塞米松衍生物作用的靶蛋白。 方法:通過將轉化有誘餌質粒pGBKT7-GRα-LBD的酵母AH109細胞、轉化有文庫質粒的酵母Y187細胞和終濃度為0.4μg/ml的地塞米松衍生物三種物質放到一起交配后，將交配后的細胞鋪于SD/-Trp/-Leu/-His的缺陷培養(yǎng)基上，然后將SD/-Trp/-Leu/-

5、His培養(yǎng)基上生長的克隆挑取到SD/Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal的缺陷培養(yǎng)基上進行營養(yǎng)缺陷篩選，重復挑取三次后仍為藍色的克隆可能是陽性克隆，然后提取酵母質粒并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，提取大腸桿菌DH5α中的質粒，并通過對所提取的所有文庫質粒進行PCR擴增和對PCR產(chǎn)物的單酶切分析，將文庫質粒歸類，歸類后從每一類中隨機選擇一個代表，通過酵母回轉實驗進行驗證。酵母回轉實驗陽性的質粒送上海生工測序，通過對測序結

6、果的比對和進一步的分析來確定所篩選到的靶蛋白的特征。 結果:共測序43個，其中有6個是重復的，實際上我們共篩選到37個不同的蛋白，經(jīng)過回轉實驗驗證，證明20個是陽性克隆，其中一個是新蛋白。從中選擇6個進行一對一的酵母交配實驗后，發(fā)現(xiàn)DDX28和RanBP9/RanBPM是與地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白。 結論:本研究我們篩選到了2個與地塞米松衍生物相互作用的靶蛋白，分別是DDX28和RanBP9/RanBPM。這將為地