用于活細(xì)胞內(nèi)金屬離子原位成像的研究及應(yīng)用.pdf

1、隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展與各種物理、化學(xué)、生物學(xué)的研究手段的應(yīng)用，使生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過程逐漸得到闡明。但是，與此同時越來越多的實驗證據(jù)表明在試管里研究得到的結(jié)果未必就完全反映了活體內(nèi)的情況。因此，要真正了解生命，必須了解生物各種活性物質(zhì)的實時變化。 熒光光譜分析及成像技術(shù)由于其方法的靈敏度高、選擇性好，在分析化學(xué)，特別是生物分析領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。大多數(shù)生物分子本身無熒光或熒光微弱，檢測靈敏度較低，為使之高靈敏地檢出，人們

2、用熒光標(biāo)記試劑或熒光生成試劑與待測物進(jìn)行標(biāo)記或衍生，生成具有高熒光強度的共價或非共價結(jié)合的物質(zhì)，大大降低檢出限。此外，借助于熒光共聚焦成像技術(shù)可以繪制活細(xì)胞內(nèi)離子的時空分布。因此，設(shè)計合成對某種金屬離子或人體內(nèi)的其它活性物質(zhì)有高選擇性、靈敏度以及合適光譜性質(zhì)的熒光探針，結(jié)合熒光成像技術(shù)，實時、在線檢測細(xì)胞內(nèi)某種金屬離子的濃度變化及在各個區(qū)域的分布，探討各種金屬離子在生命活動中所發(fā)揮的作用以及對某種離子缺陷時出現(xiàn)的病理進(jìn)行研究，實現(xiàn)自由基

3、的生物活體內(nèi)(in vivo)與直接原位(in situ)的檢測，探索自由基爆發(fā)時的致病機理，將為生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)的研究提供必要的依據(jù)。目前，熒光探針已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)許多物種的檢測，如鋅離子，超氧自由基，檸檬酸根離子，單線態(tài)氧以及一氧化氮自由基等等。 眾所周知，人體內(nèi)的金屬離子在許多生理過程中都發(fā)揮著重要的作用。其中，銅離子是人體的一種必需微量元素，其參與體內(nèi)許多生化反應(yīng)，如:維持鐵的代謝平衡；參與細(xì)胞內(nèi)的呼吸；作為輔助

4、因子，參與酶的功能性活動等等。但是，如果生物體內(nèi)，有機組織中，以及活細(xì)胞內(nèi)的銅離子穩(wěn)態(tài)水平失調(diào)，則可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)變性疾病，包括門凱氏病和肝豆?fàn)詈俗冃哉鳎易逍约∥s性側(cè)索硬化，阿爾茨海默病，以及瘋牛病等.。一方面，適量的銅離子對于生命體起著重要的作用；另一方面，過量的銅離子有機體有很大的毒害作用。因此，研究銅離子在生物組織甚至活細(xì)胞中的動態(tài)原位成像對于闡明其在生理及病理中的作用非常有意義。 H+也是細(xì)胞中一種重要的目標(biāo)靶分子

5、。眾所周知，細(xì)胞內(nèi)的H+濃度變化對細(xì)胞生長，細(xì)胞凋亡，鈣調(diào)控作用，細(xì)胞內(nèi)吞作用，細(xì)胞趨化作用以及其它細(xì)胞活動起了重要的調(diào)控作用。因此，對活細(xì)胞內(nèi)的pH變化進(jìn)行動態(tài)檢測，進(jìn)而進(jìn)行相關(guān)功能研究，對于認(rèn)識生命過程及剖析重大疾病發(fā)生機制都具有重要意義。此外，人體內(nèi)的許多陰離子在生物過程中扮演著十分重要的角色，許多酶的反應(yīng)中都需有陰離子參與。氟，是人體必需的微量元素之一，也是有毒有害元素，缺乏或過量均會引發(fā)各種疾??；過量氟對蛋白質(zhì)和DNA的合成具

6、有抑制作用，對動物的造血功能有明顯影響，能阻止原卟琳的合成，使血紅蛋白減少，從而導(dǎo)致貧血。高氟還會使與鈣、錳、鎂、銅、鐵、鋅等有關(guān)酶的活性降低，直接導(dǎo)致脂肪的利用率下降及糖代謝紊亂，從而影響動物的生長發(fā)育。氟離子還能促進(jìn)自由基的氧化過程，其含量多少與自由基的生理作用有著重要的關(guān)系。迄今，如何獲得對氟離子的專一性的識別以及如何將這種識別轉(zhuǎn)化為檢測信號仍是問題的關(guān)鍵。目前，科研工作者已成功的研制出了多種用于檢測環(huán)境及飲用水中氟離子的熒光探針

7、。但是，至今能真正適用于檢測活細(xì)胞內(nèi)氟離子水平以及用于細(xì)胞內(nèi)氟離子熒光成像的熒光探針還未見諸報道。 本論文基于生物體內(nèi)的金屬離子，氫離子以及陰離子，如：氟離子等，與熒光探針作用導(dǎo)致熒光性質(zhì)的改變，開展了三方面的工作。 (一)設(shè)計并合成了一種基于羅丹明染料的新型熒光探針，能選擇性檢測模擬生物體系內(nèi)的Cu2+，實現(xiàn)了對RAW264.7巨噬細(xì)胞中的Cu2+熒光成像。 (二)設(shè)計并合成了一種基于羅丹明染料的新型熒光