熒光探針技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)離子濃度

1、熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)離子濃度技術(shù),,陶 亮中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室,細(xì)胞內(nèi)離子,,cytoplasm,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Na+,Cl-,Ca2+,K+,Fe2+,細(xì)胞內(nèi)離子的生理功能,細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成成分 血紅蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中Cu2+維持細(xì)胞膜電位 K+、Cl-、Na+ 、Ca2+ 維持胞內(nèi)外滲透壓 Na+ 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)排泄代謝產(chǎn)物,細(xì)胞內(nèi)離子濃度異常與疾

2、病,細(xì)胞內(nèi)Ca2+異常與疾病,高血壓,骨質(zhì)疏松,癲癇,細(xì)胞內(nèi)Na+異常與疾病,心律失常,猝死,細(xì)胞內(nèi)K+異常與疾病,驚厥,陣發(fā)性舞蹈手足徐動(dòng)癥,細(xì)胞內(nèi)離子濃度測定意義,預(yù)防疾病的發(fā)生 提高疾病診斷的準(zhǔn)確性 增強(qiáng)治療療效,常用細(xì)胞內(nèi)離子濃度測定方法,常用測定方法,原子吸收光譜法 —— 微量金屬元素的測定：Na＋、K＋、 Ca2+化學(xué)滴定法 —— 有機(jī)化合物與離子可產(chǎn)生顏色變化

3、 如：Ca2+可使鉻黑T由藍(lán)變紅，使鈣鹽指示劑 鈣紅從藍(lán)變?yōu)榫萍t。放射性標(biāo)記法——放射性標(biāo)記目標(biāo)離子，如［45Ca］微電極法熒光探針法,其他新技術(shù),核磁共振法NMR,不同脲素濃度下, 通過監(jiān)測1H, 15N信號(hào)強(qiáng)度變化監(jiān)控 MMP-12 折疊過程,其他新技術(shù),生物芯片技術(shù),熒光強(qiáng)度反應(yīng)熒光標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合程度,Luis A. Rivas, e

4、t.al. A 200-Antibody Microarray Biochip for Environmental Monitoring: Searching for Universal Microbial Biomarkers through Immunoprofiling,熒光探針,熒光：某些物質(zhì)吸收了與它本身特征頻率相同的光量子后，其原子中的電子被激發(fā)到較高的能級，從而產(chǎn)生吸收光譜，有些物質(zhì)，當(dāng)用紫外線照射時(shí)，它吸收了某種波長的光

5、后還會(huì)發(fā)射處各種顏色和不同強(qiáng)度的光，而當(dāng)紫外線停止照射后，這種光也隨之消失，這種光稱之為熒光。分類：自發(fā)性熒光：組織在短波長光照射下自行發(fā)射出的熒光，如組織中蛋白質(zhì)和酯類在紫外線照射下發(fā)出微弱的淡藍(lán)色熒光； 誘發(fā)熒光：組織與熒光色素結(jié)合后，經(jīng)一定波長的光線照射后發(fā)出的熒光熒光探針：常用的誘發(fā)熒光，能產(chǎn)生熒光的生物染色劑稱之為熒光染料或熒光探針,熒光探針技術(shù)的應(yīng)用,pH測定,Guoliang Ke,et.al. A

6、Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH Sensing,pH在6.0-8.0時(shí)，不同pH值，熒光探針具有不同熒光強(qiáng)度,細(xì)胞間通訊GJIC檢測,標(biāo)記活細(xì)胞線粒體,線粒體熒光探針,骨架蛋白,Merge,Abhik Mallick,et.al. Dual Drug Conjugated Nanoparticle for Simultane

7、ous Targeting of Mitochondria and Nucleus in Cancer Cells,DNA標(biāo)記,通過X－Ray檢測口服有機(jī)硅修飾PI熒光探針的口服吸收過程,Michihiro Nakamura, et.al.Thiol-Organosilica Particles Internally Functionalized with Propidium Iodide as a Multicolor Fluores

8、cence and X‐ray Computed Tomography Probe and Application for Non-Invasive Functional Gastrointestinal Tract Imaging,細(xì)胞膜電位檢測,Jihoon Kim,et.al. Rapid Cytotoxicity Screening Platform for Amyloid Inhibitors Using a Membrane

9、-Potential Sensitive Fluorescent Probe,細(xì)胞凋亡時(shí)，膜電位改變，膜結(jié)合熒光探針的強(qiáng)度反應(yīng)細(xì)胞凋亡程度,熒光探針技術(shù)測定過程,熒光探針的負(fù)載熒光探針與目的離子結(jié)合熒光強(qiáng)度檢測：熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、雙波長熒光光度計(jì),熒光探針應(yīng)用條件,負(fù)載：探針必須局限于要測定離子濃度的區(qū)域，最常見 的部位是細(xì)胞液，但有時(shí)為線粒體；校準(zhǔn)：探針的熒光強(qiáng)度必須與游離離子濃

10、度定量相關(guān),熒光探針的負(fù)載,大量負(fù)載：AM酯負(fù)載酸負(fù)載ATP－誘導(dǎo)滲透陽離子脂質(zhì)體遞送電穿孔低滲休克單細(xì)胞負(fù)載 —— 顯微注射法膜片鉗技術(shù)微量電泳法壓力注射法,熒光探針的負(fù)載— AM酯負(fù)載,AM負(fù)載技術(shù)：Ca2+及其它陽離子探針的羧基和PH探針的酚 羥基被分別衍生為乙酰甲酯或乙酸酯，使探針可透過細(xì)胞膜并對離子不敏感，一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這些衍生的探針就可被普遍存在的細(xì)胞內(nèi)酯酶水解，釋放出離子敏感的多陰離子探針不足：

11、區(qū)室化：細(xì)胞內(nèi)膜包結(jié)構(gòu)聚集AM酯不完全水解滲漏：有機(jī)離子載體、P糖蛋白多藥載體等排除胞外,熒光探針的負(fù)載— AM酯負(fù)載,離解常數(shù)Kd：將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為離子信號(hào)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)換參數(shù)校準(zhǔn)過程：記錄對應(yīng)于精確控制的離子濃度的熒光信號(hào)，通過換算計(jì)算出解離常數(shù)Kd，,熒光探針的校準(zhǔn),熒光探針技術(shù)檢測Ca2+,Ca2+熒光探針分類,紫外光激發(fā)的熒光Ca2+探針可見光激發(fā)的熒光Ca2+探針熒光Ca2+探針交聯(lián)物生物性發(fā)光Ca2+探針,紫

12、外光激發(fā)的熒光Ca2+探針,高親和力的鈣探針：Fura-2, Indo-1及其衍生物 Fura-2－成像顯微鏡首選 Indo-1－流式細(xì)胞術(shù)首選中等親和力的鈣探針： Fura-4

13、F、Fura-5F、Fura-6F、Fura-FF、Indo-5F低親和力的鈣探針： BTC／BTC-AM，Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1金雞納皮素（Quin）-2和Quin-2 AM 吸收率和量子產(chǎn)率比低，主要用來耗竭胞質(zhì)液中游離Ca2+，確保單向性Ca2+內(nèi)流,可見光激發(fā)的熒光Ca2+探針,高親和力的鈣探針： Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2和相關(guān)

14、的衍生物基于Fluo-3和Rhod-2的低親和力的鈣探針： Fluo-5F、Fluo-4FF、Fluo-5N、Mag-Fluo-4、Rhod-5N鈣綠Calcium Green、鈣橙Calcium Orange、鈣深紅Calcium Crimson探針Fura Red探針鈣黃綠素Calcein,熒光Ca2+探針交聯(lián)物,葡聚糖交聯(lián)物：Fura、Fluo-4和Indo葡聚糖水溶性，低毒性，無生物活性抵抗內(nèi)源性糖苷酶的

15、裂解極少區(qū)室化很好的存在于活細(xì)胞內(nèi)親脂性衍生物：Fura-C18、Fura-FF-C18和鈣綠-C18與膜表面結(jié)合，檢測局部濃度變化,生物性發(fā)光Ca2+探針,水母素、重組水母素及其衍生物從發(fā)光的水母和其他海洋生物中分離得到的發(fā)光蛋白優(yōu)點(diǎn)：可排除自發(fā)熒光的干擾不滲出，不分泌不發(fā)生區(qū)室化或細(xì)胞內(nèi)隔離檢測長期間內(nèi)Ca2+變化,Fluo-4熒光探針檢測Ca2+,Bright-Field,Fluo-4 fluorescenc

16、e,Merge,Chenye Yang,et.al. Continuous Fluorescence Imaging of Intracellular Calcium by Use of Ion-Selective Nanospheres with Adjustable Spectra,熒光探針技術(shù)檢測Na+、K+及其它離子,熒光探針技術(shù)檢測Na+和K+,SBFI和PBFI及其AM酯：苯并呋喃基熒光團(tuán)連接到一種冠醚

17、 螯合劑SBFI：對Na+選擇性強(qiáng)PBFI：對K+選擇性強(qiáng) SBFI和PBFI的應(yīng)用： SBPI用于測定分離線粒體的Na+梯度或不同組織和細(xì)胞內(nèi)Na+水平或Na+外流 PBFI用于測定K+外流與細(xì)胞凋亡間關(guān)系,熒光探針技術(shù)檢測Na+,鈉綠比SBFI對Na+的選擇性更高激發(fā)波長488nm，可替代Confocal和流式細(xì)胞儀進(jìn)行

18、檢測對細(xì)胞光損傷小應(yīng)用：評估大鼠丘腦神經(jīng)元持續(xù)Na+蓄積檢測缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元Na+內(nèi)流,熒光探針技術(shù)檢測Na+,CoroNa RedCoroNa Red氯化物細(xì)胞通透性酯對Na+高選擇性應(yīng)用：對細(xì)胞的Na+內(nèi)流產(chǎn)生敏感反應(yīng)測定培養(yǎng)的上皮細(xì)胞和人肺組織氣管氣道表面液體,SBFI熒光探針技術(shù)檢測Na+,Christophe M. Lamy,et.al. Sodium Sensing in Neurons with a

19、 Dendrimer-Based Nanoprobe,Control,TTX,TTX阻斷Na+通道，Na+熒光探針標(biāo)記Na+，膜Na+電位紊亂,熒光探針技術(shù)檢測其它離子,熒光Cl－探針：6-甲氧基喹啉衍生物SPQ檢測原理：經(jīng)擴(kuò)散限制的碰撞淬滅應(yīng)用：用于檢測CFTR活性其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如GABAA、紅細(xì)胞Cl－／HCO3交換器等熒光探針技術(shù)檢測其他離子氰化物硫化物、亞硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根亞硝酸根、硝酸跟和一氧化氮磷

20、酸根和焦磷酸根硒,熒光探針技術(shù)檢測pH,熒光探針技術(shù)檢測pH,細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)液pH常為6.8－7.4，而酸性細(xì)胞器內(nèi)pH則為4.5－6.0細(xì)胞內(nèi)pH值可部分發(fā)生改變，而且速度相當(dāng)慢熒光pH探針可有效檢測不同生理和病理過程中pH變化生理范圍的pH測定－SNARF、SNAFL酸性細(xì)胞器的pH測定－LysoSensor探針,用于測定近中性pH的熒光探針,熒光素黃 —— 中性pH測定首選發(fā)射波長較長、量子產(chǎn)率高 易從細(xì)胞內(nèi)

21、流失熒光素黃衍生物BCECF－ 2`,7`-二(2-羧乙基)-5(6)-羧基熒光素不易透過細(xì)胞膜pKa=6.98,更適于生理?xiàng)l件下pH的測定SNAFLs－半萘酚熒光素類 pKa在7.6－7.9范圍內(nèi)均發(fā)生漂移,可用比率法測定體系的p H 值,SNAFLs－半萘酚熒光素類,共軛程度更大, 其吸收波長也更長,酸性pH使用的探針,LysoSensor探針與生物大分子共價(jià)結(jié)合，通過細(xì)胞固有機(jī)制主動(dòng)攝取檢測酸性細(xì)胞器，追

22、蹤酸性細(xì)胞器運(yùn)輸俄勒岡綠和二氯熒光黃衍生物,熒光探針技術(shù)檢測pH,不同pH條件下，熒光探針CN-pH熒光強(qiáng)度不同，測定熒光強(qiáng)度可計(jì)算出相應(yīng)的pH值,Baoli Dong,et.al. Dual Site-Controlled and Lysosome-Targeted Intramolecular Charge Transfer?Photoinduced Electron Transfer?Fluorescence Resona

23、nce Energy Transfer Fluorescent Probe for Monitoring pH Changes in Living Cells,熒光探針強(qiáng)度檢測方法的選擇,激光共聚焦顯微鏡 流式細(xì)胞儀 雙波長熒光光度計(jì),激光共聚焦顯微鏡（LSCM）,LSCM探針選擇,熒光探針與研究的結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系選擇熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的探針同時(shí)應(yīng)用多種熒光探針時(shí)，避免發(fā)射光譜重疊熒光探針溶劑對熒光強(qiáng)度無影響如組織需固定，選擇耐

24、受固定劑的熒光探針,熒光信號(hào)的檢測,Gm促進(jìn)Rhod－2標(biāo)記的Ca2+向胞漿轉(zhuǎn)移,Edgar J. Paredes-Gamero,et.al. Cell Permeable Gomesin Peptide Promotes Cell Death by Intracellular Ca2+ Overload,流式細(xì)胞儀,熒光探針的選擇,熒光信號(hào)檢測,Wan-Kyu Oh ,et.al. Fluorescent Polymer Nanopa

25、rticle for Selective Sensing of Intracellular Hydrogen Peroxide,檢測FITC-PAN標(biāo)記的H2O2的釋放量,雙波長熒光光度法,雙波長熒光光度法,應(yīng)用條件： a) 干擾組分在該兩波長處的吸光度相同 b) 被測組分在該兩波長的吸光度差ΔA要足夠大,雙波長熒光光度法測定Ca2+,原理：,熒光探針： 第一代：quin-2 第二代：Fura-2 —用

26、于雙波長熒光示蹤測定[Ca2+]i 第三代：Fluo-3 —用于激光光聚焦顯微鏡測定[Ca2+]i,Fura-2有二種形式,Fura-2 — 游離形式，不能透過細(xì)胞膜，可與Ca2+結(jié)合； 激發(fā)峰值: 380nm，與Ca2+結(jié)合后 → 340nm,Fura-2/AM — 酯化形式，可以透過細(xì)胞膜， 不能與Ca2+ 結(jié)合,,Fura-2

27、/AM 進(jìn)入細(xì)胞,水解形成Fura-2,Fura-2 - Ca2+,+ Ca2+,激發(fā)峰值 380nm,340nm,酯酶,［Ca2+］i = Kd Х [(F－Fmin) / (Fmax－F)] Kd: Fura-2與Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，生理?xiàng)l件下= 224nmol/L F: 實(shí)驗(yàn)記錄到的熒光比值（F340/F380）Fmax ：最大熒光值：加Ca2+載體將細(xì)胞外Ca2+載

28、入細(xì)胞測得Fmin ：最小熒光值：加螯合劑使[Ca2+]i為“0”時(shí)測得,結(jié)果計(jì)算：,雙波長熒光光度法測定Ca2+,制備細(xì)胞懸液Fura-2負(fù)載：加入溶于DMSO的Fura-2／AM，37攝氏度恒溫振蕩30-45min，負(fù)載后的細(xì)胞以含0.2%BSA的Hanks液洗2次。雙波長熒光光度計(jì)測定：測定條件——激發(fā)光光柵5nm，發(fā)射光光柵10nm，以300-420nm掃描激發(fā)光譜。如峰值在340nm，表明Fura-2已負(fù)載入細(xì)胞內(nèi)