SNAP-tag熒光探針與細(xì)胞內(nèi)蛋白標(biāo)記應(yīng)用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是細(xì)胞的重要組成部分，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)的種類繁多，至今還有很多蛋白的性質(zhì)未知，因此，對活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性熒光標(biāo)記的技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)因能夠可視化的觀測活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能而被科學(xué)家們廣泛應(yīng)用。目前常用的蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)包括基因編碼的熒光蛋白法、非天然氨基酸法和自標(biāo)記蛋白標(biāo)簽技術(shù)。但是熒光蛋白存在分子量較大、熒光光譜單一等缺點(diǎn)，而非天然氨基酸法前期基因改造復(fù)雜使其應(yīng)用存在一定的局限性。因此自標(biāo)記

2、蛋白標(biāo)簽技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于研究活細(xì)胞中蛋白質(zhì)的定位和動(dòng)態(tài)功能。至今，已經(jīng)開發(fā)了各種蛋白質(zhì)標(biāo)簽以研究活體中的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，SNAP- tag是其中最優(yōu)秀的融合標(biāo)簽之一。SNAP- tag是人源DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（hAGT）的變體，它能夠?qū)Ｒ恍缘呐c O6-芐基鳥嘌呤（O6-benzylguanine，BG）及其衍生物共價(jià)連接。目前，各種連接BG底物的熒光探針已被設(shè)計(jì)出來，而且能專一、快速、不可逆地與SNAP–tag共價(jià)連接，這使其廣泛應(yīng)用于藥物

3、監(jiān)測、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、熒光傳感器、和超分辨顯微鏡。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很好的熒光探針，但是由于背景光較強(qiáng)這些探針需要在成像之前清除。這不僅耗費(fèi)時(shí)間，而且這種清洗可能會(huì)影響實(shí)時(shí)監(jiān)測一些分子內(nèi)部的活動(dòng)（例如受體-配體結(jié)合、內(nèi)吞作用、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)龋?。此外，因?yàn)槎嘤嗟臒晒馓结樔菀自诟鞣N細(xì)胞器中堆積，我們很難做到完全清除。因此，為了克服這些困難，開發(fā)了新的具有開關(guān)效應(yīng)的熒光探針。本文采用SNAP-tag蛋白標(biāo)簽技術(shù)，用新型的熒光探針標(biāo)記體內(nèi)的蛋白

4、，能夠在免洗的條件下實(shí)時(shí)監(jiān)控蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布。基于此，本論文主要做了以下工作：
　　首先，基于熒光團(tuán)的環(huán)境敏感與淬滅機(jī)制，我們設(shè)計(jì)合成了一系列基于1,8-萘酰亞胺熒光團(tuán)的熒光探針BGAN-R（R=2C、8C、12C、DM）。通過熒光檢測、動(dòng)力學(xué)檢測等一系列實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)BGAN-2C能夠快速、專一的與SNAP-tag共價(jià)反應(yīng)，并且熒光顯著增強(qiáng)。該探針細(xì)胞毒性小，在活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，其能夠快速地標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)特定的蛋白質(zhì)。
　　隨

5、后，基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制我們設(shè)計(jì)合成了BGAN-DPA探針。通過熒光檢測、動(dòng)力學(xué)等研究，發(fā)現(xiàn)BGAN-DPA與SNAP-tag蛋白結(jié)合后熒光顯著增強(qiáng)。并且結(jié)合后的蛋白-探針復(fù)合物對銅離子有專一性響應(yīng)。最后將BGAN-DPA應(yīng)用到HEK293細(xì)胞的生物成像研究中，在免洗條件下實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)線粒體上蛋白的標(biāo)記及銅離子的檢測。
　　綜上所述，通過設(shè)計(jì)合成的新型熒光探針，實(shí)現(xiàn)了SNAP-tag蛋白在細(xì)胞內(nèi)的可視化追蹤以及細(xì)胞內(nèi)銅離子的檢測