基于熒光蛋白探針的活細(xì)胞內(nèi)多分子事件比率成像方法及其應(yīng)用.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)許多不同的分子形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來參與特定的生理事件。基于光學(xué)成像和種類眾多的熒光蛋白探針，可以更加關(guān)注于特異細(xì)胞事件中的時空特性和動力學(xué)行為。為了在單個細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用多個熒光蛋白光學(xué)探針同時檢測多分子事件，設(shè)計出具有良好光譜區(qū)分度的熒光蛋白探針是目前的研究熱點(diǎn)。多分子熒光蛋白探針應(yīng)用的挑戰(zhàn)主要在于如何合理有效地分配有限的可見光光譜資源(～400-650nm)。另外比率成像是一種可定量化的檢測方法，在多分子事件的并行檢測中的優(yōu)點(diǎn)在

2、于不受探針的濃度和光漂白等因素的影響。因為在比率成像中需要同時采集FRET探針中熒光蛋白供體和受體的光譜信號，鑒于熒光蛋白有很寬的激發(fā)和發(fā)射光譜，所以探針的光譜分配顯得尤為重要。本研究使用基于熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Frster Resonance Energy Transfer, FRET）探針和基于單熒光蛋白的Grx1-roGFP2探針，建立了單個細(xì)胞內(nèi)基于四比率探針的多分子事件同時成像的新方法。并應(yīng)用此方法，獲取了蜂毒肽（Me

3、littin）刺激下，單個細(xì)胞內(nèi)多分子事件的動力學(xué)行為。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　（1）通過熒光蛋白環(huán)化排列技術(shù)，優(yōu)化了基于cp-mLumin的熒光蛋白對，使其在用于FRET成像時，F(xiàn)RET效率優(yōu)于mLumin。
　?。?）通過合理設(shè)置與優(yōu)化FRET探針中的熒光蛋白光譜及其空間定位，最大程度地降低探針之間的光譜串?dāng)_，建立了基于四比率熒光蛋白探針的同步光學(xué)成像新方法，可用于單個細(xì)胞內(nèi)多分子事件的同步動態(tài)研究。