成像細(xì)胞內(nèi)巰基分子的新型熒光探針的研制.pdf

1、動物體內(nèi)的游離小分子物質(zhì)諸如氨基酸、小肽鏈、單糖、激素、膽固醇及核苷酸等起著不亞于細(xì)胞器的重要作用。氨基酸是含有一個堿性氨基和一個酸性羧基的有機(jī)化合物，也是組成蛋白質(zhì)的基本單元;單糖就是不能再水解的糖類，是構(gòu)成各種二糖和多糖的分子的基本單位，為整個生命系統(tǒng)提供了能量;膽固醇的體內(nèi)含量成為了現(xiàn)在評判健康狀況的重要指標(biāo);激素含量的失調(diào)更會導(dǎo)致各種疾病;核苷酸是核糖核酸及脫氧核糖核酸的基本組成單位，是體內(nèi)合成核酸的前身物。因此，探測細(xì)胞內(nèi)各種

2、游離小分子物質(zhì)的含量及分布有著重要的生物學(xué)和藥理學(xué)價(jià)值。然而，與各種細(xì)胞器不同，我們不能在光學(xué)顯微鏡甚至電子顯微鏡下直接觀察到這些小分子。故人們發(fā)展了各種各樣檢測它們的方法，諸如高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜分析方法、毛細(xì)管電泳分離分析方法、基于各種納米粒子的等離子體諧振檢測方法等。相比之下，基于熒光探針的光學(xué)探測方法具有可以原位觀測、操作方便且對細(xì)胞損傷較小等優(yōu)點(diǎn)，而得到了廣泛的研究和發(fā)展。
　　分子功能通常與分子結(jié)構(gòu)有著密不可

3、分的聯(lián)系，細(xì)胞內(nèi)游離小分子的作用往往是由其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的。硫醇類小分子含有親核性很強(qiáng)的巰基，易與其它化合物進(jìn)行親核加成反應(yīng)，與金屬離子配位，且容易被氧化形成二硫鍵，也因此在細(xì)胞內(nèi)起著其獨(dú)特的作用。半胱氨酸(Cys)作為組成蛋白質(zhì)的一種氨基酸，與蛋白質(zhì)中的二硫鍵交聯(lián)有著密不可分的聯(lián)系，對形成蛋白的三維結(jié)構(gòu)起著重要的作用。此外，半胱氨酸可以與細(xì)胞內(nèi)微量的過渡金屬離子有較強(qiáng)的配位作用，從而調(diào)節(jié)其濃度，避免了過多的重金屬離子對細(xì)胞造成的損傷。研

4、究表明，細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸濃度失調(diào)與許多疾病相關(guān)，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、帕金森癥、老年癡呆癥、不良妊娠產(chǎn)出等。還原型谷胱甘肽(GSH)可以和其氧化態(tài)(GSSH)在細(xì)胞內(nèi)保持著氧化還原平衡，還原型谷胱甘肽可以與細(xì)胞內(nèi)的氧化性物質(zhì)發(fā)生脫氫反應(yīng)，自身轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸瘧B(tài)的同時(shí)還原了這些氧化性物質(zhì)，因此維系了細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡，防止了過多的氧化性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)堆積。同型半胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)的濃度很低(只有5～15μM)，但是它卻是心血管疾病和老年癡呆癥等許多疾

5、病診斷的獨(dú)立因子，特別是，近年來人們對同型半胱氨酸的重視程度大大增加，同型半胱氨酸的含量也被一些人認(rèn)為是人體健康水平的重要指標(biāo)之一。因此，檢測細(xì)胞內(nèi)各種巰基化合物的分布和濃度對疾病診斷、藥物開發(fā)以及維持健康有著重要的意義。
　　如前文所提，巰基的強(qiáng)親核性是其在生物體內(nèi)產(chǎn)生特殊作用的基礎(chǔ)，也同時(shí)為我們探測巰醇化合物指明了方法:將一個可以選擇性的與巰基反應(yīng)的基團(tuán)與熒光團(tuán)共軛相連就得到了一個巰醇的熒光探針分子，這樣該探針分子進(jìn)入細(xì)胞后可

6、以選擇性的與巰醇化合物反應(yīng)，并給出熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)原位的檢測細(xì)胞中的巰醇化合物。如果該探測基團(tuán)可以選擇性的與特定巰醇反應(yīng)，就可以成為一個專一識別特定巰醇的探針。到目前為止，研究者們已經(jīng)合成并發(fā)展了各種各樣的巰基探針，可以與谷胱甘肽，半胱氨酸和同型半胱氨酸等其中的一種、兩種或所有巰醇反應(yīng)，給出熒光信號變化。馬來酰亞胺基團(tuán)是最早用于識別細(xì)胞內(nèi)巰醇總量的反應(yīng)基團(tuán)，基于這個識別基團(tuán)，人們已經(jīng)發(fā)展了具有各種光譜性質(zhì)的巰基探針。Strongin課

7、題組首先開創(chuàng)性的利用單醛來專一識別半胱氨酸和同型半胱氨酸，隨后，以單醛為識別基團(tuán)的半胱氨酸和同型半胱氨酸探針也得到了廣泛的發(fā)展。由于半胱氨酸具有相對較強(qiáng)的反應(yīng)活性，目前能專一識別半胱氨酸而同時(shí)不受同型半胱氨酸影響的熒光探針有了一定的發(fā)展，Jung課題組發(fā)展了具有查爾酮結(jié)構(gòu)的化合物，它們通過與三種巰基化合物反應(yīng)速率的不同專一性的識別半胱氨酸;我們課題組在之前的工作中也曾報(bào)道過兩個可以專一識別半胱氨酸的探針AM1和CA1，這兩個探針雖然以單

8、醛為官能團(tuán)，但是卻不和同型半胱氨酸響應(yīng)，這可以歸結(jié)為半胱氨酸具有更高的反應(yīng)活性。相反的，同型半胱氨酸的反應(yīng)活性較弱，因此在同濃度下，專一識別同型半胱氨酸的探針尚不多見。Strongin課題組曾報(bào)道了在等濃度下可以篩選出同型半胱氨酸的探針。值得一提的是，細(xì)胞內(nèi)各種巰醇的濃度差別很大，谷胱甘肽的細(xì)胞內(nèi)濃度為1～10mM，半胱氨酸的細(xì)胞內(nèi)濃度為30～200μM，同型半胱氨酸的細(xì)胞內(nèi)濃度為5～15μM。因此若要專一性的識別半胱氨酸和同型半胱氨酸

9、，還必須考慮較大濃度的谷胱甘肽的干擾，這為細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸或同型半胱氨酸的熒光探針設(shè)計(jì)提供了更大的難度。
　　在本文的工作中，我們設(shè)計(jì)和合成了9個小分子探針:以丙烯醛為識別基團(tuán)的探針CB1和HOTA;以單醛為識別基團(tuán)的探針HMCA、BMCA和NMCA;以硝基丙烯或丙烯腈為識別基團(tuán)的探針HMCN、HOVC、HODVC和HOBVC。
　　探針CB1分子是以3-(4-吡啶乙烯基)-9-乙基咔唑?yàn)闊晒饽阁w，烯基醛為識別基團(tuán)的熒光探針。

10、值得一提的是，探針CB1分子可以先后和兩分子的半胱氨酸或同型半胱氨酸發(fā)生兩步反應(yīng)，可以和一分子的谷胱甘肽發(fā)生加成反應(yīng)。且CB1分子在乙醇和緩沖液的混合液中是弱熒光的，然而其和一分子各種巰基化合物的反應(yīng)可以使其熒光強(qiáng)度大幅度提升，但在反應(yīng)速率上有很大的差別:探針分子可以很快的完成和一分子半胱氨酸的反應(yīng)(40min);探針分子和同型半胱氨酸的反應(yīng)速率要慢很多，需要24h左右才能夠完成反應(yīng);探針分子和谷胱甘肽的反應(yīng)速率極慢，只有在一周以后才會

11、有明顯的熒光增強(qiáng)。同時(shí)，探針分子還可以和第二分子的半胱氨酸或同型半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)的結(jié)果是使探針分子的熒光恢復(fù)到弱熒光的狀態(tài):探針分子和半胱氨酸的第二分子反應(yīng)在24h時(shí)幾乎已經(jīng)完全完成;探針分子和同型半胱氨酸的第二分子反應(yīng)在一周時(shí)幾乎完全完成。如此巧妙的兩步反應(yīng)速率使探針分子可以在三個時(shí)間窗口實(shí)現(xiàn)分別專一性檢測半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽的目的:40min時(shí)只有CB1-半胱氨酸體系具有強(qiáng)熒光，實(shí)現(xiàn)了半胱氨酸的檢測;24h時(shí)，CB

12、1-半胱氨酸體系的熒光變?nèi)酰挥蠧B1-同型半胱氨酸體系具有強(qiáng)熒光，實(shí)現(xiàn)了同型半胱氨酸的檢測;一周后，CB1-半胱氨酸和CB1-同型半胱氨酸體系的熒光都變?nèi)?，這時(shí)CB1-GSH體系具有強(qiáng)熒光，實(shí)現(xiàn)了谷胱甘肽的專一性檢測?？紤]到CB1具有很好的選擇性及靶向后的物質(zhì)具有很好的雙光子性能，我們利用該探針進(jìn)行了寬場顯微鏡以及雙光子顯微鏡的成像研究。
　　探針HOTA分子是以4-羥基苯乙烯基三苯胺為母體，具有和CB1相同的識別基團(tuán)烯基醛，能

13、夠在加入半胱氨酸后短時(shí)間內(nèi)高選擇性的選擇半胱氨酸，而同型半胱氨酸和谷胱甘肽幾乎不發(fā)生干擾作用。特別是，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的濃度幾乎是半胱氨酸的四十多倍，在真實(shí)的細(xì)胞濃度下，谷胱甘肽依舊不會帶來明顯的干擾。因此我們利用探針HOTA進(jìn)行了寬場顯微鏡下的成像研究，為了證實(shí)探針在細(xì)胞中的熒光信號來自半胱氨酸，我們利用谷胱甘肽合成酶的抑制劑BSO抑制了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成，并進(jìn)行了與正常細(xì)胞的對比成像實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明用BSO處理后的細(xì)胞與未處理的細(xì)

14、胞熒光強(qiáng)度幾乎相同，也證實(shí)了細(xì)胞中的熒光確實(shí)來自半胱氨酸。
　　探針分子HMCA、BMCA和NMCA都是以單醛為識別基團(tuán)的熒光探針，由于醛基的存在，這三種分子在乙醇和緩沖液的混合體系中都是弱熒光的，三個分子都能和同型半胱氨酸和半胱氨酸反應(yīng)，帶來熒光強(qiáng)度的變化，與常報(bào)道的探針分子不同，它們對同型半胱氨酸具有更強(qiáng)的響應(yīng)性，在同等濃度下是一個同型半胱氨酸的探針。HMCN分子是以硝基丙烯為識別基團(tuán)的探針，探針分子本身是弱熒光的，它能夠無差