活細(xì)胞內(nèi)示蹤乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、經(jīng)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記后的病毒，可以在活細(xì)胞中顯示并研究它們。但GFP 并不適合標(biāo)記乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），因?yàn)镠BV是一種體積較小的病毒體，它的內(nèi)部空間狹小，無(wú)法容納GFP 這樣一個(gè)含有238個(gè)氨基酸的大片段的摻入。最近有報(bào)道稱(chēng)：融合了四半胱氨酸標(biāo)簽(tetracysteine tag,TC tag)的目的蛋白可以被一種雙砷熒光染料在活細(xì)胞中

2、特異地標(biāo)記。這種雙砷標(biāo)記技術(shù)為活細(xì)胞中HBV的熒光示蹤和研究又提供了新的機(jī)遇。
　　 目的:制造重組的經(jīng)雙砷染料標(biāo)記的熒光HBV，從而在活細(xì)胞中示蹤并研究HBV。
　　 方法:應(yīng)用分子克隆和PCR 定點(diǎn)突變技術(shù)，以含1.3 倍HBV基因組的載體為模板，在其編碼的核心蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)c/e1表位（the immunodominant c/e1 site）附近插入一個(gè)特殊的TC標(biāo)簽，這個(gè)標(biāo)簽可以同雙砷熒光染料特異地結(jié)合。構(gòu)建所

3、得的重組的HBV 載體被轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中用于表達(dá)TC 嵌合型核心蛋白。應(yīng)用Westernblotting，免疫熒光以及雙砷標(biāo)記分析這種蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。此外，表達(dá)這種TC 嵌合型核心蛋白的細(xì)胞用雙砷染料印跡后，繼續(xù)被培養(yǎng)，用于制造熒光HBV 病毒體。應(yīng)用投射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）和激光共聚焦顯微鏡鑒定熒光HBV 病毒體的產(chǎn)生，并進(jìn)一步調(diào)查這些熒光病毒對(duì)DMSO

4、處理過(guò)的HepG2細(xì)胞的感染性。最終，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡在活細(xì)胞中直接觀察熒光HBV的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 結(jié)果:編碼TC 嵌合型核心蛋白的HBV 載體被成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染了這些HBV 載體的細(xì)胞可以表達(dá)TC 嵌合型核心蛋白并制造成熟的HBV 病毒體。而且，細(xì)胞中結(jié)合了雙砷染料的TC 嵌合型核心蛋白可以特異地發(fā)出熒光，并組裝入HBV 核心顆粒中進(jìn)而形成熒光HBV 病體，這些病毒體保留了同野生型HBV 病毒體類(lèi)似的感染性。
　　 這