乙型肝炎病毒在人類卵母細(xì)胞和早期胚胎內(nèi)整合的研究.pdf

1、乙型肝炎是危害人類健康的全球性疾病.全球有20多億人有乙型肝炎病毒(1aepatitis B virus,HBV)的感染史,其中約有3.5億人為HBV的慢性攜帶者.目前,約有1/3的世界人口生活在HBV感染率較高的地區(qū).HBV的感染與8096的原發(fā)性肝細(xì)胞癌具有相關(guān)性,每年約有100多萬人死于因HBV感染引起的嚴(yán)重肝臟疾病,WHO已將HBV的感染列為世界第九大死亡原因.我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū),乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B

2、 surface antigen,HBsAg)攜帶者達(dá)10﹪-15﹪,每年有50萬-100萬的新增病例. 目前,經(jīng)過適當(dāng)?shù)闹鲃?dòng)、被動(dòng)聯(lián)合免疫,能夠有效阻斷多數(shù)HBV的感染,但免疫接種后仍然有10﹪～20﹪的嬰兒阻斷失敗,阻斷失敗的原因不明. HBV的傳播途徑有輸血;體液接觸(包括血清、唾液、陰道分泌物、乳汁和精液接觸);宮內(nèi)感染;細(xì)胞、組織和器官移植;血液透析工具和藥物靜脈注射等.此外,還有一種新的、尚待證實(shí)的傳播方式,

3、即垂直傳播. 垂直傳播:指患者的生殖細(xì)胞受病毒感染,在受精時(shí)由精子或卵細(xì)胞作為載體,將病毒基因帶到胚胎進(jìn)而使子代患病.按性別劃分,垂直傳播又分為父嬰垂直傳播和母嬰垂直傳播. 阻斷失敗是否與垂直傳播相關(guān)?對(duì)于HBV垂直傳播的研究可能有助于這一問題的回答.關(guān)于父嬰垂直傳播,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),精子內(nèi)存在著HBV DNA的整合,并且主要存在于乙型肝炎患者精子頭的膜部和核心部,精子被感染的機(jī)制涉及對(duì)HBV D

4、NA的主動(dòng)捕獲,這些研究表明HBV可能通過精子細(xì)胞進(jìn)行垂直傳播.又有研究發(fā)現(xiàn),在母方HBsAg陰性,父方精子HBV DNA陽性的引產(chǎn)胎兒全身多個(gè)器官如肝臟、小腸、腎、肺及肌肉組織內(nèi)存在著完整的HBV DNA,并且父嬰間HBV的序列同源性達(dá)到98﹪-100﹪.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,將脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒直接注射到雄鼠體內(nèi),HBV DNA能夠進(jìn)入雄性生殖細(xì)胞,整合到宿主基因組內(nèi),并通過自然受精隨精子進(jìn)入卵母細(xì)胞,在早期胚胎中復(fù)制與表達(dá),從而為乙肝患者可

5、能通過受染精子向子代傳播HBV建立了體內(nèi)研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?為HBV的父嬰垂直傳播途徑提供了相關(guān)的科學(xué)證據(jù).對(duì)于HBV母嬰垂直傳播的研究,由于卵母細(xì)胞不易獲得,母嬰傳播過程復(fù)雜,受到多因素、多環(huán)節(jié)的影響,又缺乏理想的動(dòng)物模型等因素的影響,該項(xiàng)研究很難進(jìn)行.與此同時(shí),長(zhǎng)期以來,一些學(xué)者認(rèn)為卵母細(xì)胞外的透明帶可能阻止外源基因進(jìn)入卵母細(xì)胞.在2006年,有一項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)在卵巢組織內(nèi)不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞核內(nèi)存在HBcAg的表達(dá),動(dòng)物試驗(yàn)表明,H

6、BV能整合進(jìn)入小鼠卵母細(xì)胞內(nèi),并在小鼠的二細(xì)胞胚內(nèi)存在復(fù)制與表達(dá),這表明HBV母嬰垂直傳播存在可能.但是,上述相關(guān)人的卵母細(xì)胞的研究較少,可重復(fù)性也有待進(jìn)一步研究證明,此外,目前研究多集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,對(duì)于處于生物進(jìn)化的最高層次的人類胚胎尚缺少相關(guān)研究,因此,本研究旨在利用生物素標(biāo)記的含全長(zhǎng)HBV DNA的pBR322-HBV DNA質(zhì)粒探針進(jìn)行熒光原位雜交(fluorescenece in situ hybirdization,FI

7、SH)檢測(cè)HBV DNA是否能整合進(jìn)入生殖細(xì)胞,以及進(jìn)入生殖細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA是否能順利通過受精遺傳至早期胚胎,從而為HBV的垂直傳播提供直接證據(jù). 材料與方法: 選擇2006年6月-2007年1月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院就診行輔助生育技術(shù)治療并經(jīng)ELISA檢查的16例女方HBsAg陽性的35個(gè)未受精卵,22對(duì)女方HBsAg陽性夫婦的27個(gè)廢棄胚胎、15對(duì)男方HBsAg陽性夫婦的26個(gè)廢棄胚胎以及8對(duì)夫婦雙方H

8、BsAg均為陽性的21個(gè)廢棄胚胎,共74個(gè)廢棄胚胎為實(shí)驗(yàn)組:24對(duì)夫婦雙方HBV兩對(duì)半檢測(cè)均為陰性的12個(gè)未受精卵和34個(gè)廢棄胚胎為陰性對(duì)照組;Hepa 1175肝癌細(xì)胞為陽性對(duì)照組.以異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)標(biāo)記的pBR322-HBV DNA探針進(jìn)行熒光原位雜交浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目,項(xiàng)目編號(hào)Y 206148(fluorescenece in situ hybirdizatio

9、n,FISH)檢測(cè)HBV DNA在卵母細(xì)胞和早期胚胎基因組內(nèi)的整合,以DIG標(biāo)記的HBX DNA探針對(duì)最后3次洗滌液進(jìn)行斑點(diǎn)雜交排除HBV DNA陽性信號(hào)來自于卵泡液或細(xì)胞膜的可能.所有研究對(duì)象均無免疫缺陷綜合癥病史.標(biāo)本的收集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn),并經(jīng)患者知情同意. 結(jié)果： 35個(gè)卵母細(xì)胞中1個(gè)卵母細(xì)胞染色體上檢測(cè)到特異性的HBV DNA信號(hào),陽性檢出率為2.9﹪(1/35);74個(gè)胚胎中11個(gè)早期胚胎細(xì)胞的1-4

10、個(gè)細(xì)胞核內(nèi)(含雙原核受精卵到桑椹胚不同發(fā)育階段胚胎)檢測(cè)到特異性的HBV DNA信號(hào),胚胎細(xì)胞的陽性檢出率為14.9﹪(11/74),兩者間雖存在差異,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.卵母細(xì)胞和胚胎總的陽性率為11.0﹪(12/109).女方曲sag陽性、男方HBsAg陽性和夫婦雙方HBsAg陽性的胚胎陽性檢出率分別為14.8﹪(4/27)、11.5﹪(3/26)和19.0﹪(4/21),各組間陽性檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并在2個(gè)8細(xì)胞胚胎的同一個(gè)細(xì)胞核內(nèi)

11、均檢測(cè)到2個(gè)HBV DNA信號(hào).早期胚胎內(nèi)檢測(cè)到陽性信號(hào)的夫婦雙方至少有一方為HBeAg和(或)同時(shí)存在preS1陽性的胚胎所占百分比為81.8﹪(9/11).陰性對(duì)照卵母細(xì)胞和胚胎均未見特異性的HBV DNA信號(hào);陽性對(duì)照的肝癌細(xì)胞內(nèi)可見特異性的HBV DNA信號(hào).最后3次洗滌液標(biāo)本斑點(diǎn)雜交檢測(cè)HBV DNA陰性,排除了FISH陽性結(jié)果來自細(xì)胞膜或卵泡液污染的可能. 結(jié)論： (1)卵母細(xì)胞基因組內(nèi)存在HBV DNA的整