發(fā)育微環(huán)境對卵母細胞和早期胚胎線粒體的影響.pdf

1、第一部分超促排卵對卵母細胞和早期胚胎線粒體的影響
　　 目的：線粒體是供應能量、調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)的重要細胞器，也是唯一能遺傳DNA的細胞器，與卵子和胚胎發(fā)育潛能相關。在卵母細胞成熟過程中，線粒體發(fā)生數量、形態(tài)分布和功能的一系列變化。超促排卵使卵巢超越生理調控同步發(fā)育多個卵子，其干預階段正是卵母細胞胞質成熟、線粒體儲備完善的階段。多項研究提示超促排卵可以改變卵巢微環(huán)境，獲得的卵子質量下降，因此超促排卵應用的安全性值得探討。本項目通過小鼠

2、模型，對比超促排卵和非超促排卵卵子體外受精后發(fā)育潛能，同時檢測卵子和早期胚胎線粒體的數目、形態(tài)、功能、線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的異質性以及卵巢組織的氧化損傷和抗氧化能力，以探討超促排卵時卵巢環(huán)境改變對卵母細胞線粒體的影響以及與發(fā)育潛能的關系。
　　 方法：采用C57BL/6J小鼠，注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，HCG)為超促排

3、卵組，自然動情期注射HCG為對照組。收集兩組所獲得的卵子和體外受精后所獲的胚胎。采用實時PCR法檢測單卵/胚胎mtDNA拷貝數、熒光素酶法檢測單卵/胚胎ATP、JC-1染色檢測線粒體膜電位(Mitochondrialmembranepotential，△Ψm)、MitoTrackerRed染色觀察線粒體分布、電鏡觀察線粒體超微結構以及用變性高效液相色譜法檢測mtDNA的異質性。對比兩組間的卵子成熟度、胚胎發(fā)育狀況、線粒體各指標的差異以及

4、卵巢組織的氧化損傷產物和總抗氧化能力的差異。
　　 結果：
　　 1.與對照組相比，超促排卵組取卵成功率高(P<0.01)，獲卵總數多(P<0.01)，受精卵多(P<0.01)，卵裂胚胎數多(P<0.01)，形成囊胚數多(P<0.01)，但獲得的不成熟卵和低潛能卵子比例高。
　　 2.超促排卵組獲得的MⅡ卵和受精卵的線粒體拷貝數低于對照組(P<0.01，P<0.05)，獲得的2細胞胚胎和囊胚線粒體拷貝數與對照組差

5、異無顯著性。
　　 3.超促排卵組獲得的MⅡ卵和受精卵的ATP含量低于對照組(P<0.01，P<0.05)，獲得的2細胞胚胎和囊胚的ATP含量與對照組差異無顯著性。
　　 4.超促排卵組獲得的MⅡ卵的△Ψm低于對照組(P<0.01)，獲得的2細胞胚胎和囊胚的△Ψm與對照組差異無顯著性。
　　 5.電鏡顯示超促排卵組獲得的部分MⅡ卵線粒體稀少，MitoTrackerRed熒光染色顯示超促排卵組MⅡ卵線粒體分布極性聚

6、集比例高于對照組(P<0.01)。
　　 6.超促排卵組與對照組均未檢測到mtDNAD-loop區(qū)的異質性。
　　 7.單次超促排卵的卵巢氧化損傷產物與對照組相比無明顯差異，總抗氧化能力高于對照組(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.超促排卵增加取卵成功率、增加獲卵總數和高發(fā)育潛能卵子總數。
　　 2.超促排卵同時也募集了不成熟卵和線粒體儲備低下的卵子，這些卵子在隨后的受精和胚胎發(fā)育過程中被

7、淘汰，超促排卵獲得的囊胚其線粒體數量、功能與對照組無顯著差異。
　　 3.單次超促排卵與對照組相比不顯著增加卵子mtDNAD-loop區(qū)的突變頻率。
　　 第二部分子宮內膜異位癥腹腔液對早期胚胎線粒體的影響
　　 目的：子宮內膜異位癥(內異)與不孕存在很強的相關性。輕度盆腔內異患者沒有輸卵管和卵巢的解剖異常但也常伴有不孕。內異是炎癥性和免疫性疾病。內異腹腔液含有炎癥因子、活性氧和活性氮，能抑制胚胎發(fā)育，但機制未明

8、。線粒體是胚胎發(fā)育潛能的重要決定因素，對環(huán)境極其敏感，是炎癥因子和各種自由基作用的靶細胞器，易受損而誘發(fā)細胞凋亡。本研究通過分析輕度內異不孕患者助孕治療的臨床資料、其腹腔液一氧化氮(nitricoxide，NO)的含量以及腹腔液對小鼠胚胎線粒體的影響，來探討輕度內異盆腔微環(huán)境對早期胚胎的影響，尋求其相關不孕的最佳處理方式。
　　 方法：對腹腔鏡探查證實為輕度內異患者進行術后隨訪，與輸卵管性不孕組對比，分析兩組體外受精-胚胎移植(

9、invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET)治療的臨床特征。同時收集腹腔液檢測其NO代謝物的含量，用含不同濃度硝普鈉(sodiumnitroprusside，SNP，是NO的供體)的培養(yǎng)液孵育鼠胚，觀察NO對早期胚胎發(fā)育的影響。將腹腔液按10％比例摻入培養(yǎng)液進行鼠胚培養(yǎng)，計算鼠胚卵裂率和囊胚形成率，同時用實時PCR法測定單胚胎mtDNA拷貝數、熒光素酶法測定單胚胎ATP、JC-1染色檢測胚胎線粒

10、體膜電位(Mitochondrialmembranepotential，△Ψm)、電鏡觀察線粒體超微結構，對比組間胚胎線粒體各指標的差異。
　　 結果：
　　 1.輕度內異患者IVF受精率顯著低于輸卵管性不孕(P<0.05)，而獲卵率、卵裂率、優(yōu)胚率、種植率、妊娠率和流產率兩組之間均無顯著性差異。
　　 2.內異組腹腔液NO顯著高于對照組(P<0.01)。含10-6M和10-4MSNP培養(yǎng)液孵育鼠胚的卵裂率和囊胚

11、形成率降低(P<0.01)，而10-8M組卵裂率和囊胚形成率變化不顯著。
　　 3.內異組腹腔液孵育鼠胚的卵裂率和囊胚形成率低于非內異組和對照組(P<0.01)。
　　 4.內異組腹腔液孵育鼠胚的2細胞期和4細胞期胚胎的ATP含量、△Ψm高于非內異組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義，而組間線粒體拷貝數差異無顯著性。
　　 結論：
　　 1.輕度內異患者IVF-ET治療的療效與輸卵管性不孕無顯著差異。