干細(xì)胞微環(huán)境對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟、胚胎發(fā)育的影響及其生物活性因子分析.pdf

1、研究背景:
　　近三十年來(lái),輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)的發(fā)展迅速。據(jù)統(tǒng)計(jì),在西方國(guó)家大約有近1％的兒童的出生有賴于ART技術(shù)的運(yùn)用。目前臨床常用的ART方法有:體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)、卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection,

2、ICSI)、胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)、贈(zèng)卵IVF-ET以及配子和胚胎冷凍技術(shù)等。ART中所需的卵母細(xì)胞大多數(shù)是通過(guò)對(duì)患者行控制性超排卵獲得,在一定程度上提高了ART的妊娠率。但控制性超排卵也存在一些弊端及并發(fā)癥,如卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)、乳腺癌、卵巢癌發(fā)病的潛在危險(xiǎn)、醫(yī)療費(fèi)用高、就醫(yī)時(shí)間長(zhǎng)等。因此,臨床上急需一種新的獲取成熟卵母細(xì)胞的方法。
　　未成

3、熟卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)即模擬卵母細(xì)胞成熟體內(nèi)環(huán)境,使從卵巢采集的未成熟卵母細(xì)胞在體外適宜培養(yǎng)條件下達(dá)到最后成熟并具有受精能力,成為解決這些問(wèn)題的有效途徑。未成熟卵IVM技術(shù)培養(yǎng)出大量成熟的卵母細(xì)胞用于體外受精,支持移植前胚胎的發(fā)育,在ART中發(fā)揮重要的作用。但I(xiàn)VM技術(shù)仍然存在一些弊端,究其原因還是由于尚未建立理想的培養(yǎng)體系。目前體外成熟體系中所用的培養(yǎng)液是向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加血清、白蛋白、各

4、種細(xì)胞因子和激素等,在一定程度上提高了體外成熟的效率。但仍然存在卵母細(xì)胞成熟率低、核質(zhì)成熟不同步和卵母細(xì)胞質(zhì)量差等不足,所以必須優(yōu)化培養(yǎng)體系。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種成體干細(xì)胞,存在于動(dòng)物的骨髓腔中,不僅具有自我更新和多向分化功能,而且可以分泌多種細(xì)胞因子,如表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulinlike growth factors,IGF)、白血病抑制因子(

5、Leukemia inhibitory factor,LIF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor,TGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等。在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、卵母細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞也可以分泌這一系列細(xì)

6、胞因子,促進(jìn)和調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的分化、發(fā)育和成熟過(guò)程。本課題組前期的研究表明,MSCs條件培養(yǎng)液能夠促進(jìn)小鼠卵巢組織中卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟及胚胎的發(fā)育。因此,MSC微環(huán)境可能是一種較理想的IVM體系,能模擬卵母細(xì)胞細(xì)胞成熟的體內(nèi)微環(huán)境,從而使卵母細(xì)胞具有良好的發(fā)育潛能,提高受精率和胚胎發(fā)育能力。本研究擬進(jìn)一步評(píng)價(jià)MSCs條件培養(yǎng)液促進(jìn)小鼠未成熟卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育的作用,并分析其中生物活性因子,為完善IVM培養(yǎng)體系提供依據(jù)。
　　目的

7、:
　　探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)條件培養(yǎng)液(CM)對(duì)小鼠未成熟卵母細(xì)胞體外成熟作用,對(duì)IVF后的胚胎發(fā)育的影響,及其發(fā)揮作用的機(jī)制,為優(yōu)化IVM培養(yǎng)體系提供依據(jù)。
　　方法:
　　1)分離、培養(yǎng)小鼠MSCs,獲得MSCs條件培養(yǎng)液。
　　2)收集3類生發(fā)泡(GV)期卵母細(xì)胞,分別在對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM、Stempro)和條件培養(yǎng)液(DCM、SCM)中培養(yǎng),觀察卵母細(xì)胞成熟率,判斷最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　3

8、)FDA、Hoechst33342和PI聯(lián)合染色評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞細(xì)胞的活力。
　　4)熒光標(biāo)記檢測(cè)皮質(zhì)顆粒分布、遷移及紡錘體復(fù)合物的形成情況,評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)成熟情況。
　　5)IVM卵母細(xì)胞和體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞體外受精和胚胎培養(yǎng),分別計(jì)算受精率、4-cell形成率、囊胚形成率,通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察體外培養(yǎng)胚胎的發(fā)育情況。
　　6)囊胚用hoechst33342染色,熒光顯微鏡下觀察囊胚內(nèi)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞形成情況,計(jì)數(shù)囊胚內(nèi)的

9、總細(xì)胞數(shù),評(píng)價(jià)囊胚質(zhì)量。
　　7)濃縮、收集MSC條件培養(yǎng)液中的蛋白進(jìn)行電泳,高效液相色譜結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定條件培養(yǎng)液中含有的蛋白因子。
　　結(jié)果:
　　1)3類卵母細(xì)胞在條件培養(yǎng)液中IVM后,其形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯的變化,出現(xiàn)核成熟表現(xiàn)。條件培養(yǎng)液組3類生發(fā)泡期卵母細(xì)胞的成熟率高于對(duì)照培養(yǎng)基組;其中,A類(完全∕大部分裸露)生發(fā)泡卵母細(xì)胞和B類(周圍有疏松的顆粒細(xì)胞包裹)生發(fā)泡卵母細(xì)胞的最佳體外成熟時(shí)間為16 h,D類(有

10、完整的數(shù)層顆粒細(xì)胞緊密包裹)生發(fā)泡卵母細(xì)胞的最佳體外成熟時(shí)間為24 h。
　　2)體外成熟卵母細(xì)胞活力良好,皮質(zhì)顆粒分布及紡錘體復(fù)合物形成與體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞一致,表明胞質(zhì)已成熟。
　　3)IVM的卵母細(xì)胞IVF后胚胎發(fā)育良好,受精率、4-cell形成率和囊胚形成率及囊胚內(nèi)細(xì)胞總數(shù)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。IVM組囊胚內(nèi)細(xì)胞染色后的熒光圖像與體內(nèi)成熟組一致。
　　4)通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用分析MSC條件培養(yǎng)液,檢出50