乙型肝炎病毒DNA在人卵母細(xì)胞和胚胎中的整合及HBV感染婦女ART結(jié)局的研究.pdf

1、背景:
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一種引起乙型肝炎(haepaltitiS B)的嗜肝性病毒。全球有20多億人有乙型肝炎病毒感染史,其中約有3.5億人為HBV的慢性攜帶者,HBV的感染與80％的原發(fā)性肝細(xì)胞癌具有相關(guān)性,每年約有100多萬(wàn)人死于因HBV感染引起的嚴(yán)重肝臟疾病。我國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū),1-60歲人群中HBsAg陽(yáng)性率為7.2％,其中處在婚育年齡人群乙肝病毒攜帶率近10％。

2、>　　 乙型肝炎病毒廣泛存在于乙肝患者的體液中,如唾液、淚液、汗液、乳汁、精液、內(nèi)分泌液和血液。血清HBeAg、HBV-DNA和Pre-S1均是反應(yīng)乙肝病毒復(fù)制或傳染性的重要指標(biāo),在HBV感染早期,具有較高的一致檢出率,然而HBVDNA是復(fù)制活動(dòng)最直接和可靠的指標(biāo)。傳播渠道多樣化:輸血、性交、醫(yī)源性及密切的生活接觸等水平傳播和父嬰、母嬰之間的垂直傳播(vertical transmission)。垂直傳播是HBV傳播的主要途徑之一,其

3、可分為母嬰傳播和父嬰傳播。母嬰垂直傳播可分為3個(gè)水平:產(chǎn)前傳播、產(chǎn)時(shí)傳播及產(chǎn)后傳播。產(chǎn)前傳播可分為經(jīng)胎盤(pán)傳播(transplacental transmission)和經(jīng)生殖細(xì)胞(generative cells)傳播。近年來(lái),經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)闹鲃?dòng)、被動(dòng)聯(lián)合免疫干預(yù),能夠有效阻斷多數(shù)HBV的感染,但仍然有約10％的嬰兒阻斷失敗。研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)生殖腺及生殖細(xì)胞如睪丸,精子、精漿以及卵巢中的顆粒細(xì)胞、卵細(xì)胞中有HBV的存在和表達(dá),從而使得乙型肝炎

4、病毒經(jīng)生殖細(xì)胞進(jìn)行垂直傳播的學(xué)說(shuō)得以發(fā)展。
　　 乙型肝炎病毒亦可影響人類(lèi)生殖能力。HBV感染可以通過(guò)全身或局部的免疫作用、病毒基因的整合干擾基因組正常機(jī)能以及肝炎病毒蛋白表達(dá)影響精子的產(chǎn)生、導(dǎo)致形態(tài)和活力的改變,從而降低人類(lèi)生殖能力。隨著人類(lèi)輔助生殖技術(shù)日益進(jìn)步、人類(lèi)生活模式變化以及環(huán)境的影響,越來(lái)越多的人接受輔助生殖技術(shù)助孕治療,其中不乏有乙型肝炎攜帶不孕夫婦。在這一領(lǐng)域中,病毒感染影響輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局的問(wèn)題引起人們的關(guān)

5、注。然而,HBV感染是否降低輔助生殖治療的結(jié)局?目前尚未有一致的觀點(diǎn)。
　　 本課題擬研究乙型肝炎病毒攜帶患者血清和卵泡液中病毒載量的關(guān)系;體內(nèi)病毒復(fù)制狀態(tài)與發(fā)生經(jīng)卵母細(xì)胞垂直傳播的關(guān)系;女性乙肝病毒攜帶者血清和卵泡液中病毒含量與輔助生殖治療結(jié)局的關(guān)系,為臨床對(duì)HBV攜帶患者開(kāi)展ART治療提供理論依據(jù)。
　　 材料與方法:
　　 收集2009年2月～2009年12月在浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖內(nèi)分泌科接受常規(guī)體外

6、受精/卵胞漿單精子注射.胚胎移植治療的176例乙肝病毒攜帶婦女的血清和卵泡液;176例中的106例乙肝病毒攜帶婦女廢棄的卵母細(xì)胞206個(gè)及胚胎441個(gè)。采用熒光定量PCR方法檢測(cè)血清與卵母細(xì)胞的:HBV DNA濃度,用HBV DNA全長(zhǎng)作為探針采用原位雜交方法(Fluorescence in sire hybridization,FISH)檢測(cè)HBVDNA在胚胎和卵母細(xì)胞中的整合。通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件分析血清和卵泡液中病毒載量與發(fā)生HBV DN

7、A在卵母細(xì)胞和胚胎中整合的關(guān)系。同時(shí)選擇2006年01月-2009年12月在本中心接受體外受精助孕治療的513對(duì)女性乙肝病毒攜帶不孕夫婦的557個(gè)周期作為暴露組。以女方年齡(年齡±1)、取卵時(shí)間(天數(shù)±1)以及ART受精方式(IVF和ICSI)作為匹配條件,利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件隨機(jī)抽取1:1本院同年的,夫婦雙方均為乙肝陰性周期作為非暴露組。兩組建立回顧性隊(duì)列,分析女方乙肝攜帶對(duì)于著床率(孕囊數(shù)/ET胚胎數(shù))、臨床妊娠率(超聲證實(shí)為宮內(nèi)孕

8、婦女?dāng)?shù)/完成移植周期數(shù))、流產(chǎn)率(發(fā)生流產(chǎn)婦女?dāng)?shù)/宮內(nèi)孕婦女總數(shù)),分娩數(shù)(完成分娩婦女?dāng)?shù)/完成胚胎移植周期數(shù))以及周期得孩率(活產(chǎn)胎兒數(shù)/ART啟動(dòng)周期數(shù)),同時(shí)分析女性體內(nèi)病毒復(fù)制狀態(tài)如HBeAg血清狀態(tài)、血清病毒拷貝數(shù)及卵泡液中病毒含量對(duì)于ART結(jié)局的影響。
　　 結(jié)果:
　　 血清中HBV DNA陽(yáng)性檢出率為54.4％,卵泡液可檢測(cè)到乙肝病毒DNA,陽(yáng)性率為45.7％;多數(shù)血清中HBV DNA含量高于卵泡液(P＜

9、0.05),然而少部分患者其卵泡液中病毒含量較血清中高。線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血清和卵泡液間乙肝病毒DNA含量存在中等強(qiáng)度正相關(guān),(R=0.427,P=0.001)。卵母細(xì)胞內(nèi)HBV DNA整合信號(hào)的陽(yáng)性率為8.25％,早期胚胎內(nèi)的陽(yáng)性率為12.92％;HBeAg陽(yáng)性組卵母細(xì)胞的HBV DNA陽(yáng)性率顯著高于HBeAg陰性組(14.8％VS4.5％,P＜0.05),前者胚胎的陽(yáng)性率較后者有增高趨勢(shì)(17.1％VS10.6％,P=0.051);血

10、清HBV DNA＞106組胚胎及卵母細(xì)胞中HBV DNA整合的陽(yáng)性率顯著高于HBV DNA＜106組(P＜0.05);卵泡液中HBVDNA＞105組胚胎及卵母細(xì)胞中HBV DNA整合的陽(yáng)性率顯著高于HBV DNA＜105組(P＜0.05);著床率、臨床妊娠率、以及周期得孩率陽(yáng)性組較陰性對(duì)照組稍低而流產(chǎn)率稍增加,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),活胎分娩周期在陽(yáng)性組中顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);HBV DNA＞105病人流產(chǎn)率HBV

11、 DNA＜105組顯著性增加,周期得孩率顯著性降低(P＜0.05);卵泡液HBV DNA陽(yáng)性組的著床率、臨床妊娠率、活胎分娩周期以及周期得孩率較陰性組顯著性降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、乙型肝炎病毒攜帶患者卵泡液中存在乙肝病毒的復(fù)制;
　　 2、進(jìn)一步驗(yàn)證乙肝病毒DNA可整合到人卵母細(xì)胞和胚胎中;
　　 3、卵泡液中的HBV DNA含量多數(shù)較血清中低,兩者存在中等程度的正相關(guān);
　

12、　 4、血清HBeAgN性病毒在卵母細(xì)胞中的整合率顯著增高;
　　 5、血清HBV DNA＞1.0×106拷貝/毫升,卵跑液中HBv DNA濃度≥1.0×105持貝毫升時(shí)病毒在卵母細(xì)胞及胚胎中的整合率顯著增高;
　　 6、乙肝攜帶狀態(tài)對(duì)婦女卵巢儲(chǔ)備能力以及卵巢對(duì)促排卵治療的反應(yīng)性無(wú)影響;
　　 7、女方乙肝攜帶夫婦經(jīng)體外受精胚胎移植治療后最終獲得活胎分娩的周期較陰性對(duì)照組有顯著性降低;
　　 8、女方血