分子信標(biāo)用于活細(xì)胞內(nèi)源性mRNA檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　分子信標(biāo)作為一種新型的熒光標(biāo)記核酸探針，其在體外應(yīng)用時(shí)具有實(shí)時(shí)、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)，但是在活細(xì)胞體內(nèi)的應(yīng)用較少，尤其在斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域尚未見(jiàn)應(yīng)用分子信標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道。嘗試將分子信標(biāo)應(yīng)用到斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)進(jìn)行研究，對(duì)進(jìn)一步指導(dǎo)分子信標(biāo)在動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用諸如其對(duì)基因檢測(cè)及示蹤等具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)分子信標(biāo)在活細(xì)胞體內(nèi)的應(yīng)用，為其進(jìn)一步應(yīng)用于斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)及其他在體水平的基因檢測(cè)和示蹤提供潛在的方法。通過(guò)分子信標(biāo)對(duì)于心

2、臟特異性基因mRNA的體內(nèi)追蹤，達(dá)到追蹤心臟極早期發(fā)育譜系、研究心臟早期發(fā)育的目的。
　　方法：
　?。ㄒ唬┓肿有艠?biāo)特異性結(jié)合靶序列的體外研究
　　1.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
　　分子信標(biāo)的穩(wěn)定性包含本身序列的完整性和熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性兩個(gè)方面，其中溫度是影響分子信標(biāo)穩(wěn)定性的重要條件。我們將分子信標(biāo)在37℃水浴了不同的時(shí)間，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定溫度對(duì)分子信標(biāo)穩(wěn)定性的影響，并進(jìn)一步通過(guò)熔解曲線分析方法檢測(cè)溫度對(duì)其熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性

3、的影響。
　　2.特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)
　　分子探針與其靶序列結(jié)合的特異性和靈敏度也是決定其應(yīng)用價(jià)值的關(guān)鍵因素。我們利用體外合成的特定靶基因序列對(duì)分子信標(biāo)與靶基因結(jié)合的特異性和靈敏度進(jìn)行了分析。首先通過(guò)熔解曲線來(lái)鑒定分子信標(biāo)與靶基因結(jié)合的特異性，其次鑒定分子信標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度與靶基因濃度相關(guān)性。
　?。ǘ┓肿有艠?biāo)在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)mRNA及其特異性的研究
　　在體外驗(yàn)證了分子信標(biāo)的穩(wěn)定性及其特異性后，我們繼續(xù)在細(xì)胞水平觀察

4、分子信標(biāo)在細(xì)胞內(nèi)的對(duì)mRNA結(jié)合的特異性。我們首先將eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，而后將靶向eGFP的分子信標(biāo)分別轉(zhuǎn)染表達(dá)eGFP的293T細(xì)胞及普通293T細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染分子信標(biāo)的表達(dá)eGFP的293T細(xì)胞為空白組，分別在激光顯微鏡下觀察熒光。
　?。ㄈ┓肿有艠?biāo)特異性結(jié)合靶序列的體內(nèi)研究
　　在體的分子信標(biāo)與靶基因結(jié)合的特異性和敏感性是我們進(jìn)一步的研究方向。通過(guò)顯微注射分別將分子信標(biāo)以及外源性目標(biāo)單鏈導(dǎo)入野生型的斑馬魚(yú)

5、胚胎內(nèi)后在胚胎內(nèi)觀察其熒光。分別于單細(xì)胞期胚胎共注射分子信標(biāo)及其目標(biāo)單鏈，共注射分子信標(biāo)及隨機(jī)單鏈，單獨(dú)注射分子信標(biāo)，觀察熒光表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　（一）分子信標(biāo)的體外穩(wěn)定性
　　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:48小時(shí)內(nèi)，37℃水浴不同時(shí)間分子信標(biāo)經(jīng)電泳鑒定未見(jiàn)降解，熔解曲線結(jié)果顯示在37℃條件下48小時(shí)內(nèi)，分子信標(biāo)的熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。提示分子信標(biāo)在體外具有穩(wěn)定性。
　　（二）分子信標(biāo)與靶基因

6、體外結(jié)合具有特異性與靈敏度
　　將靶序列按不同濃度分組，熔解曲線的結(jié)果顯示加入靶序列的分子信標(biāo)組較單獨(dú)分子信標(biāo)組的信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且分子信標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度與靶基因濃度呈正相關(guān)。提示分子信標(biāo)在體外與靶基因結(jié)合具有特異性及敏感性。
　?。ㄈ┓肿有艠?biāo)在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)mRNA及其特異性的研究
　　將靶向eGFP標(biāo)記Cy3的分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染進(jìn)eGFP表達(dá)的293T細(xì)胞，能看到紅色熒光表達(dá)，且紅色熒光表達(dá)

7、的范圍局限于綠色熒光表達(dá)的范圍之內(nèi)，靶向eGFP的分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染進(jìn)普通293T細(xì)胞、隨機(jī)分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染eGFP表達(dá)的293T細(xì)胞均未見(jiàn)紅色熒光表達(dá)。提示分子信標(biāo)在活細(xì)胞內(nèi)能特異性檢測(cè)mRNA。
　?。ㄋ模┓肿有艠?biāo)特異性結(jié)合靶序列的體內(nèi)研究
　　將靶向eGFP且?guī)y3標(biāo)記的分子信標(biāo)以及eGFP的DNA單鏈于單細(xì)胞期共注射入斑馬魚(yú)胚胎。可觀察到可檢測(cè)的紅色熒光穩(wěn)定表達(dá)48小時(shí)以上;單獨(dú)注射分子信標(biāo)的空白組以及注射分子信標(biāo)及隨機(jī)單鏈

8、的對(duì)照組均未見(jiàn)熒光表達(dá)。提示分子信標(biāo)在體內(nèi)可以特異性結(jié)合靶序列。
　　結(jié)論：
　?。ㄒ唬┪覀兂晒υO(shè)計(jì)、合成了eGFP的分子信標(biāo)，該分子信標(biāo)在體外具有很好的穩(wěn)定性、與靶基因結(jié)合的特異性及敏感性。
　　（二）分子信標(biāo)在活細(xì)胞內(nèi)可特異性結(jié)合靶序列，檢測(cè)內(nèi)源性mRNA。
　?。ㄈ┓肿有艠?biāo)在斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)能在體內(nèi)穩(wěn)定存在48小時(shí)以上并能特異地與其靶基因結(jié)合，提示其能被應(yīng)用于斑馬魚(yú)胚胎內(nèi)及其他在體水平內(nèi)源性基因的檢測(cè)和示蹤的