分子信標用于活細胞內(nèi)源性mRNA檢測的實驗研究.pdf

1、目的：
　　分子信標作為一種新型的熒光標記核酸探針，其在體外應用時具有實時、高靈敏度、高特異性等特點，但是在活細胞體內(nèi)的應用較少，尤其在斑馬魚研究領(lǐng)域尚未見應用分子信標進行實驗的相關(guān)報道。嘗試將分子信標應用到斑馬魚胚胎內(nèi)進行研究，對進一步指導分子信標在動物體內(nèi)的應用諸如其對基因檢測及示蹤等具有較強的應用價值。通過分子信標在活細胞體內(nèi)的應用，為其進一步應用于斑馬魚胚胎內(nèi)及其他在體水平的基因檢測和示蹤提供潛在的方法。通過分子信標對于心

2、臟特異性基因mRNA的體內(nèi)追蹤，達到追蹤心臟極早期發(fā)育譜系、研究心臟早期發(fā)育的目的。
　　方法：
　?。ㄒ唬┓肿有艠颂禺愋越Y(jié)合靶序列的體外研究
　　1.穩(wěn)定性實驗
　　分子信標的穩(wěn)定性包含本身序列的完整性和熒光強度的穩(wěn)定性兩個方面，其中溫度是影響分子信標穩(wěn)定性的重要條件。我們將分子信標在37℃水浴了不同的時間，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定溫度對分子信標穩(wěn)定性的影響，并進一步通過熔解曲線分析方法檢測溫度對其熒光強度穩(wěn)定性

3、的影響。
　　2.特異性和靈敏度實驗
　　分子探針與其靶序列結(jié)合的特異性和靈敏度也是決定其應用價值的關(guān)鍵因素。我們利用體外合成的特定靶基因序列對分子信標與靶基因結(jié)合的特異性和靈敏度進行了分析。首先通過熔解曲線來鑒定分子信標與靶基因結(jié)合的特異性，其次鑒定分子信標的信號強度與靶基因濃度相關(guān)性。
　?。ǘ┓肿有艠嗽诩毎麅?nèi)檢測mRNA及其特異性的研究
　　在體外驗證了分子信標的穩(wěn)定性及其特異性后，我們繼續(xù)在細胞水平觀察

4、分子信標在細胞內(nèi)的對mRNA結(jié)合的特異性。我們首先將eGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進293T細胞，而后將靶向eGFP的分子信標分別轉(zhuǎn)染表達eGFP的293T細胞及普通293T細胞，以未轉(zhuǎn)染分子信標的表達eGFP的293T細胞為空白組，分別在激光顯微鏡下觀察熒光。
　?。ㄈ┓肿有艠颂禺愋越Y(jié)合靶序列的體內(nèi)研究
　　在體的分子信標與靶基因結(jié)合的特異性和敏感性是我們進一步的研究方向。通過顯微注射分別將分子信標以及外源性目標單鏈導入野生型的斑馬魚

5、胚胎內(nèi)后在胚胎內(nèi)觀察其熒光。分別于單細胞期胚胎共注射分子信標及其目標單鏈，共注射分子信標及隨機單鏈，單獨注射分子信標，觀察熒光表達。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┓肿有艠说捏w外穩(wěn)定性
　　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:48小時內(nèi)，37℃水浴不同時間分子信標經(jīng)電泳鑒定未見降解，熔解曲線結(jié)果顯示在37℃條件下48小時內(nèi)，分子信標的熒光強度差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。提示分子信標在體外具有穩(wěn)定性。
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6、體外結(jié)合具有特異性與靈敏度
　　將靶序列按不同濃度分組，熔解曲線的結(jié)果顯示加入靶序列的分子信標組較單獨分子信標組的信號強度顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，且分子信標的信號強度與靶基因濃度呈正相關(guān)。提示分子信標在體外與靶基因結(jié)合具有特異性及敏感性。
　?。ㄈ┓肿有艠嗽诩毎麅?nèi)檢測mRNA及其特異性的研究
　　將靶向eGFP標記Cy3的分子信標轉(zhuǎn)染進eGFP表達的293T細胞，能看到紅色熒光表達，且紅色熒光表達

7、的范圍局限于綠色熒光表達的范圍之內(nèi)，靶向eGFP的分子信標轉(zhuǎn)染進普通293T細胞、隨機分子信標轉(zhuǎn)染eGFP表達的293T細胞均未見紅色熒光表達。提示分子信標在活細胞內(nèi)能特異性檢測mRNA。
　?。ㄋ模┓肿有艠颂禺愋越Y(jié)合靶序列的體內(nèi)研究
　　將靶向eGFP且?guī)y3標記的分子信標以及eGFP的DNA單鏈于單細胞期共注射入斑馬魚胚胎?？捎^察到可檢測的紅色熒光穩(wěn)定表達48小時以上;單獨注射分子信標的空白組以及注射分子信標及隨機單鏈

8、的對照組均未見熒光表達。提示分子信標在體內(nèi)可以特異性結(jié)合靶序列。
　　結(jié)論：
　?。ㄒ唬┪覀兂晒υO(shè)計、合成了eGFP的分子信標，該分子信標在體外具有很好的穩(wěn)定性、與靶基因結(jié)合的特異性及敏感性。
　?。ǘ┓肿有艠嗽诨罴毎麅?nèi)可特異性結(jié)合靶序列，檢測內(nèi)源性mRNA。
　　（三）分子信標在斑馬魚胚胎內(nèi)能在體內(nèi)穩(wěn)定存在48小時以上并能特異地與其靶基因結(jié)合，提示其能被應用于斑馬魚胚胎內(nèi)及其他在體水平內(nèi)源性基因的檢測和示蹤的