人間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化水平影響干細(xì)胞存活的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在探討人間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化水平影響干細(xì)胞存活的分子機(jī)制。
　　方法：
　　利用細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）/雙氧水（H2O2）協(xié)同誘導(dǎo)了一個(gè)與體內(nèi)環(huán)境相似的體外氧化炎癥壓力環(huán)境。應(yīng)用依達(dá)拉奉作為抗氧化劑和馬來(lái)酸二乙酯（diethylmaleate，DEM）作為促氧化劑預(yù)處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal ste

2、m cells,hUCMSCs）后的不同時(shí)間點(diǎn)，測(cè)定干細(xì)胞存活能力、細(xì)胞凋亡和內(nèi)源性抗氧化水平的動(dòng)態(tài)變化。其中，采用免疫熒光染色法和caspase-3/7活性法測(cè)定細(xì)胞凋亡的變化；用MTT評(píng)估細(xì)胞活性；用活性氧（reactive oxygen species，ROS）染色和GSH/GSSH比值顯示細(xì)胞內(nèi)抗氧化水平。然后，用定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax-1的mRNA表達(dá)水平變化；用蛋白免疫印跡法（Weste

3、rn blot，WB）測(cè)定內(nèi)源性抗氧化酶中超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase-1，SOD1）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和MAPK、PKC通路各蛋白的表達(dá)變化；用試劑盒測(cè)定Nrf2轉(zhuǎn)錄活性，以期對(duì)調(diào)控干細(xì)胞凋亡和內(nèi)源性抗氧化水平的分子機(jī)制進(jìn)行探究。最后，用PD98059和staurosporine分別阻斷MAPK和PKC通路；用基因沉默的方法阻斷Nrf2的抑制蛋白質(zhì)Keap1的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證MAPK

4、-PKC-Nrf2通路在影響干細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化水平中的作用。
　　結(jié)果：
　　(1)與對(duì)照組比較，LPS/H2O2處理組干細(xì)胞活性降低(P<0.05)；與 LPS/H2O2組比較，促氧化劑DEM預(yù)處理后在所有時(shí)間點(diǎn)都進(jìn)一步降低了干細(xì)胞活性(P<0.05)；與 LPS/H2O2組比較，兩種不同濃度的依達(dá)拉奉處理組（Eda）均提高了LPS/H2O2刺激下干細(xì)胞的增殖活性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且兩組 Eda濃度間比

5、較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；此外，依達(dá)拉奉預(yù)處理改善了由LPS/H2O2刺激導(dǎo)致的hUCMSCs細(xì)胞形態(tài)的異常，而DEM則進(jìn)一步加劇該異常；
　　(2)結(jié)果顯示與LPS/H2O2處理組比較，依達(dá)拉奉預(yù)處理組的10μM和20μM濃度組均降低了hUCMSCs細(xì)胞凋亡率，DEM預(yù)處理組增高了h UCMSCs細(xì)胞凋亡率，二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05; P<0.001）；caspa se-3/7的活性變化與細(xì)胞凋亡率變化一致；qPC

6、R結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，在處理后12、24、36、48、60、72小時(shí)（h）后，LPS/H2O2組的抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA表達(dá)率低，而促凋亡蛋白Bax1的mRNA表達(dá)率增高（P<0.001)；不同濃度的依達(dá)拉奉預(yù)處理后，可以抵消這種作用；DEM預(yù)處理后，進(jìn)一步降低了Bcl-2和提高了Bax1的水平；
　　(3)從處理后24h開(kāi)始，與對(duì)照組比較，LPS/H2O2組培養(yǎng)基中DCFH-D A（ROS熒光染色劑）信號(hào)更明顯，依達(dá)

7、拉奉預(yù)處理組減弱，而DEM預(yù)處理組加劇；GSH/GSSG比值變化與ROS表達(dá)情況相符：與對(duì)照組比較，在處理后12、24、36、48、72h時(shí)，LPS/H2O2組均引起胞內(nèi)GSH/GSSG比率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；這種降低在依達(dá)拉奉組（10μM和20μM）被抵消，而在DEM組更低；
　　(4) Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS/H2O2處理后的12、24、36、60和72 h，過(guò)氧化氫酶（

8、CAT）和超氧化物歧化酶1（SOD1）蛋白的表達(dá)顯著降低，尤其是SOD1的表達(dá)；與LPS/H2O2組比較，依達(dá)拉奉預(yù)處理組蛋白表達(dá)高，DEM預(yù)處理組蛋白表達(dá)低(P<0.05）；
　　(5)測(cè)定MAPK通路結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，LPS/H2O2處理組在大部分時(shí)間點(diǎn)表達(dá)更高水平的磷酸化的p38MAPK和ERK1/2。依達(dá)拉奉預(yù)處理組及 DEM預(yù)處理組分別可以消除和增強(qiáng) LPS/H2O2的該效應(yīng)；用PD98059和PKC抑制劑分別阻斷

9、MAPK和PKC通路后，20μM依達(dá)拉奉組對(duì)細(xì)胞活性降低的升高作用被消除；應(yīng)用基因沉默 Keap1可以增強(qiáng)Nrf2的活性(P<0.001)，并可以部分逆轉(zhuǎn)DEM對(duì)細(xì)胞活性的影響。
　　結(jié)論：
　?。?）抗氧化劑依達(dá)拉奉預(yù)處理改善了氧化炎癥刺激下hUCMSCs的形態(tài)學(xué)和生存能力；
　?。?）抗氧化劑依達(dá)拉奉預(yù)處理后通過(guò)上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的水平和下調(diào)促凋亡基因Bax-1 mRNA水平降低hUCMSCs的凋亡