轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子核酸酶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的優(yōu)化.pdf

1、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子核酸酶(transcription activator-like effectornucleases，TALENs)是繼鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)之后的第二代人工核酸酶技術(shù)。因TALENs的DNA結(jié)合域——轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子(transcription activator-like effector，TALE)不具有上下文效應(yīng)，且脫靶效應(yīng)(off-target effects)遠(yuǎn)較Z

2、FNs低，便于設(shè)計(jì)和應(yīng)用，取得較ZFNs更廣闊的應(yīng)用空間。與CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)技術(shù)相比，TALENs構(gòu)建較為復(fù)雜，但因其穩(wěn)定性好且脫靶效率低，顯得略勝一籌。本研究旨在優(yōu)化TALENs在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，包括對TALENs模塊組裝方法(unit assembly，UA)和線粒體內(nèi)的表達(dá)效率的優(yōu)化。
　　在對TALENs模塊組裝方

3、法的優(yōu)化方面，本研究提供了一種新型的TALENs模塊組裝法及活性鑒定方法。利用TALE-NT2.0在線工具在線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)上設(shè)計(jì)TALENs識(shí)別位點(diǎn)和剪切位點(diǎn)，借助pEGFP-N1質(zhì)粒將該段靶序列隨機(jī)整合于HEK293F核基因組中，構(gòu)建HEK293F-T1細(xì)胞系，用于TALENs活性鑒定。依據(jù)TALE自然單元模塊序列，設(shè)計(jì)出一種新型的人工TALE偏單元;根據(jù)TALENs識(shí)別位點(diǎn)，選取相應(yīng)一

4、單元模塊，利用UA法組裝;并設(shè)計(jì)出含有相應(yīng)雙酶切位點(diǎn)的TALE串聯(lián)模塊序列和TALENs載體序列，定向連接后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293F-T1細(xì)胞系。結(jié)果顯示，新型模塊組裝法定向組裝TALE模塊，克隆效率高且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后可看到清晰的套峰。
　　在對TALENs線粒體內(nèi)表達(dá)效率的優(yōu)化方面，本研究提供了一種基于TALENs的mtDNA編輯工具。利用能跨膜進(jìn)入線粒體的線粒體靶向TALENs(mitochondria-targeted TALEN

5、s，mtTALENs)表達(dá)載體，誘導(dǎo)mtTALENs定位于線粒體并進(jìn)行mtDNA編輯。將TALENs的核定位信號(hào)序列(nuclear localization signal，NLS)替換為線粒體前導(dǎo)肽序列(mitochondrial targeting sequence，MTS)，構(gòu)建mtTALENs(MTS)，并添加了出核信號(hào)肽序列(nuclear export signal，NES)，構(gòu)建mtTALENs(MTS+NES)。通過細(xì)胞

6、免疫熒光技術(shù)檢測mtTALENs與線粒體共定位情況;通過粗提線粒體，檢測線粒體內(nèi)mtTALENs的含量;觀察測序峰圖中的套峰，來檢測mtTALENs對核基因組的干擾。結(jié)果顯示，帶有MTS和NES的mtTALENs與只帶有MTS的mtTALENs相比，二者均可以定位于線粒體，但前者效率較高，且對核基因組干擾較小。
　　總而言之，新型模塊組裝方法提高了TALENs構(gòu)建過程中的克隆效率，并且不受末位0.5模塊的重復(fù)可變雙氨基酸殘基(re