環(huán)境嗜肺軍團(tuán)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)特征及致病機(jī)制研究.pdf

1、第一部分環(huán)境嗜肺軍團(tuán)菌在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)特征
　　[目的]嗜肺軍團(tuán)菌是一種胞內(nèi)生長(zhǎng)菌，可引起爆發(fā)性、致死性肺炎，水體環(huán)境中定植的嗜肺軍團(tuán)菌是人軍團(tuán)菌病的主要感染源。本研究采用醫(yī)院供水系統(tǒng)中分離的菌株，研究環(huán)境嗜肺軍團(tuán)菌(Environmental Legionella pneumophila，LPE)在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)特征及機(jī)制。[方法]以臨床分離的嗜肺軍團(tuán)菌費(fèi)城株的衍生菌株JR32作為對(duì)照菌株，通過(guò)細(xì)菌定量培養(yǎng)觀察LPE

2、在A/J小鼠骨髓巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophage from A/J mouse，BMDMA/J)，人巨噬細(xì)胞U937和阿米巴宿主盤(pán)基網(wǎng)柄菌胞內(nèi)的生長(zhǎng)情況。隨后通過(guò)對(duì)LPE509中Dot/Icm IVB型分泌系統(tǒng)(Type IVB Secretion System，T4BSS)的組成和β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPE509運(yùn)輸效應(yīng)蛋白至宿主胞漿的功能。最后通過(guò)對(duì)宿主蛋白R(shí)ab1，LAMP-1和細(xì)菌囊泡的

3、熒光染色研究感染早期宿主蛋白對(duì)LPE509囊泡的錨定及其在胞內(nèi)的發(fā)展。[結(jié)果](1) LPE509在人巨噬細(xì)胞U937和盤(pán)基網(wǎng)柄菌內(nèi)可有效生長(zhǎng)，但在BMDMM內(nèi)的生長(zhǎng)受限。敲除dotA基因可限制LPE509在U937細(xì)胞中的生長(zhǎng)，但不影響其在BMDMA/J中的生長(zhǎng)。(2)基因測(cè)序顯示結(jié)果LPE509具有由27個(gè)基因組成的完整的T4BSS;β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)位實(shí)驗(yàn)顯示LPE509對(duì)效應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能與JR32相似(1pg1171:76.3±3

4、.9＜ vs70.5±7.8，P＞0.05;lpg0796:56.9±4.9＜ vs60±6.0＜，P＞0.05)。(3)熒光染色顯示LPE509感染小鼠巨噬細(xì)胞后1h，2h和6h對(duì)宿主蛋白LAMP-1和Rab1的招募作用與JR32相比無(wú)明顯差別(P＞0.05)。(4) LPE509感染BMDMA/J后14 h，發(fā)展為大型囊泡的比率顯著小于JR32(18.2±2.0％ vs66.0±5.2＜，P＜0.001)。(5) LPE509感染B

5、MDMA/J后14h蓋玻片上細(xì)胞數(shù)量較感染前顯著減少，其比率大于由JR32感染引起的細(xì)胞數(shù)量減少(44.9±14.5％ vs9.4±16.3＜，P＜0.05)。(6) LPE509感染BMDMA/J后5h，囊泡破壞比率顯著高于JR32感染后囊泡破壞的比率(60.0±11.7％ vs15.5±0.06＜，P＜0.001)。[結(jié)論]與既往研究的臨床嗜肺軍團(tuán)菌不同，LPE509具有宿主特異性的生長(zhǎng)限制。其機(jī)制可能與宿主細(xì)胞對(duì)細(xì)菌囊泡的破壞及L

6、PE509感染引起的造成宿主細(xì)胞的急劇減少有關(guān)。
　　第二部分環(huán)境嗜肺軍團(tuán)菌感染導(dǎo)致小鼠巨噬細(xì)胞焦亡及其機(jī)制
　　[目的]研究環(huán)境嗜肺軍團(tuán)菌在小鼠巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生長(zhǎng)受限原因及可能的機(jī)制。[方法]本研究以JR32作為對(duì)照菌株，通過(guò)Hoechst/PI雙核酸染色技術(shù)，LDH釋放實(shí)驗(yàn)和TUNEL染色確定LPE509感染BMDMA/J后發(fā)生的細(xì)胞死亡形式，并通過(guò)對(duì)感染細(xì)胞上清液中HMGB1和IL-1β的檢測(cè)了解在細(xì)胞死亡過(guò)程中伴隨的炎

7、癥因子釋放。隨后使用敲除flaA基因的LPE509感染小鼠巨噬細(xì)胞并檢測(cè)由此引起的細(xì)胞死亡以確定細(xì)菌鞭毛蛋白在導(dǎo)致細(xì)胞死亡中的作用。通過(guò)對(duì)caspase-1/11-/-小鼠巨噬細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)確定caspase1和caspase11在LPE509導(dǎo)致的細(xì)胞死亡中的作用。最后，使用EMS隨機(jī)突變方法篩選出一個(gè)LPE509的突變子，并初步確定了可能影響LPE509胞內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌毒力因子。[結(jié)果](1)LPE509感染導(dǎo)致的細(xì)胞PI染色陽(yáng)性率，L

8、DH釋放及TUNEL染色陽(yáng)性率均顯著高于JR32(PI:44.2±2.0＜ vs5.0±1.4＜,P＜0.001;LDH:2 h16.3±2.7＜ vs1.1±1.0＜,P＜0.001,4 h34.2±5.3＜ vs12.9±1.3＜,P＜0.01;TUNEL:42.4±4.8＜ vs17.9±1.3＜,P＜0.01)。(2) LPE509感染小鼠巨噬細(xì)胞后可引起HMGB1和IL-1β的釋放，而LPE509△dotA感染后未檢測(cè)到HMG

9、B1和IL-1△的釋放。(3) LPE509△flaA菌株感染A/J小鼠和C57BL/6小鼠巨噬細(xì)胞后均不能在胞內(nèi)生長(zhǎng)，并且感染后細(xì)胞PI染色陽(yáng)性和TUNEL染色陽(yáng)性率仍顯著高于JR32(PI:37.2±5.2＜ vs5.0±1.4＜，P＜0.001;TUNEL:38.2±2.8＜ vs17.9±1.3＜,P＜0.001)。(4) LPE509和LPE509△flaA感染caspase-1/11-/-小鼠巨噬細(xì)胞后仍不能在胞內(nèi)生長(zhǎng)，且L

10、PE509△flaA感染后導(dǎo)致的LDH釋放顯著高于JR32△flaA(63.4±5.1％ vs12.5±1.9＜，P＜0.001)。LPE509和LPE509△flaA感染caspase-1/11-/-小鼠巨噬細(xì)胞后所引起的IL-1β釋放較感染C57BL/6小鼠的IL-1β釋放減少。(5)使用EMS隨機(jī)突變，我們篩選到一株LPE509突變子可在BMDMA/J進(jìn)行增殖?；蚪M測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)了在蛋白編碼基因lvrA，lpg1594, lpg