嗜肺軍團(tuán)菌DNA疫苗的初步研究.pdf

1、軍團(tuán)病(Legionnaire's disease)是由于吸入含有致病性軍團(tuán)菌感染所致的一種以非典型肺炎或Pantiac熱為主要表現(xiàn)常伴多系統(tǒng)損害的急性細(xì)菌性傳染病，病程進(jìn)展快，免疫功能低下者易感，由于其癥狀不典型，常被誤診誤治，病死率高，易暴發(fā)流行。軍團(tuán)菌廣泛存在于土壤、江河湖等天然水、井水和自來水生活用水、現(xiàn)代城市廣泛使用的空調(diào)的冷卻塔水、加濕器內(nèi)水及其它人工水環(huán)境在內(nèi)各種水體環(huán)境中，是一種革蘭氏陰性兼性菌，可寄生于原蟲中，作為一種

2、病原體，它可侵入哺乳動(dòng)物巨噬細(xì)胞，逃避吞噬體和溶酶體的殺傷作用，并在其中生長繁殖。軍團(tuán)菌目前己發(fā)現(xiàn)有48種70個(gè)血清型，致病性軍團(tuán)菌主要包括嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)血清l～15型、L.micdadei、L.gormanii、L.bozemanii等，其中嗜肺軍團(tuán)菌占96.4％；在美國，90％的軍團(tuán)病由嗜肺軍團(tuán)菌引起，而其中79％為血清1型(LPl)。我國及其它許多國家已將軍團(tuán)病列為需要重點(diǎn)防治的一種新發(fā)

3、傳染病，但目前尚無理想的防治措施，因此，研制出安全有效的疫苗對軍團(tuán)病防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究在查閱分析國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)及結(jié)合本室研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，選定嗜肺軍團(tuán)茵DNA疫苗作為研究方向，具體選擇了lvgA基因、htpa和Hsp60基因?yàn)橐呙绾蜻x基因，并將免疫刺激序列CpG基序構(gòu)建于lvgA基因側(cè)翼，以及采用重組PCR法實(shí)現(xiàn)了嗜肺軍團(tuán)菌lvgA及Hsp60基因融合，構(gòu)建了lvgA基因、引入CpG基序的lvgA基因及l(fā)vgA／Hap60融

4、合基因的重組真核表達(dá)載體等疫苗，并檢測其免疫原性和免疫保護(hù)性指標(biāo)，為最終研制出新一代安全、高效嗜肺軍團(tuán)菌DNA疫苗提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究共分六部分進(jìn)行： 第一部分，以嗜肺軍團(tuán)菌血清l型(L1)菌株基因組DNA為模板，采用常規(guī)PCR法擴(kuò)增出627bp的lvgA基因，隨后將其定向連接入克隆載體pUCl8，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pUlvgA，再將lvgA基因亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGlv

5、gA，經(jīng)誘導(dǎo)，約53.7 Ku的GST-LvgA融合蛋白質(zhì)在原核系統(tǒng)中得到了有效的表達(dá)。 第二部分，采用PCR法從嗜肺軍團(tuán)菌基因組DNA中擴(kuò)得htpA基因，繼而將其定向克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-l中，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGhtpA，并誘導(dǎo)GST-HtpA融合蛋白在原核系統(tǒng)中得到了有效的表達(dá)。 第三部分，采用重組PCR法實(shí)現(xiàn)了嗜肺軍團(tuán)菌lvgA及Hsp60基因融合，融合基因lvgA／Hsp60被克隆入原核表達(dá)質(zhì)

6、粒pGEX-4T-l中，構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGlvgA／Hsp60,并使GST-LvgA-Hsp60融合蛋白在原核系統(tǒng)中得到了有效的表達(dá)。 第四部分，通過PCR引物設(shè)計(jì)將特定的免疫刺激序列CpG基序引入lvgA基因的上下游，并將PCR產(chǎn)物lvgA／CpG定向克隆入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1myc-his(+)中，真核表達(dá)重組質(zhì)粒pclvgA／CpG同樣，將前述lvgA基因和lvgA／Hsp60融合基因亦分別亞克隆至pcDN

7、A3.1myc-his(+)中，得到真核表達(dá)重組質(zhì)粒pclvgA和pclvgA／Hsp60。將前述三種真核表達(dá)重組質(zhì)粒分別用脂質(zhì)體和殼聚糖(chitosan)轉(zhuǎn)染途徑轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞NTH3T3細(xì)胞后，用免疫熒光法檢測到各克隆基因蛋白有效的瞬時(shí)表達(dá)，隨后用western印跡檢測到所轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞克隆穩(wěn)定表達(dá)出克隆基因編碼大小的條帶。 第五部分，將構(gòu)建好的真核表達(dá)重組質(zhì)粒作為DNA疫苗，除了以裸DNA注射免疫BALB／c小鼠外，還加設(shè)

8、殼聚糖包封pclvgA免疫組，檢測免疫小鼠體內(nèi)的抗體水平、脾淋巴細(xì)胞增殖活性、IFN-γ產(chǎn)生水平、CTL殺傷活性等指標(biāo)，評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白質(zhì)粒對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組均檢測到程度不同的免疫原性，差異有顯著性(P<0.01)：pclvgA／CpG免疫組抗體的滴度高于其它各實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)；pclvgA／CpG和pclvgA／Hsp60免疫組細(xì)胞免疫各項(xiàng)指標(biāo)高于pclvgA、pcHsp60,．pclvgA／bcHsp60

9、和chitosan／pclvgA免疫組。與pclvgA免疫組相比，在用較其它免疫組所用質(zhì)粒半量的情況下，chitosan／pclvgA免疫組能誘發(fā)相當(dāng)水平的體液免疫及細(xì)胞免疫，且各指標(biāo)在各檢測點(diǎn)呈比較平穩(wěn)的上升趨勢。 第六部分，將構(gòu)建好的真核表達(dá)重組質(zhì)粒作為DNA疫苗同前部分免疫BALB／c小鼠，加強(qiáng)免疫后，用嗜肺軍團(tuán)菌L1型菌株對免疫小鼠進(jìn)行攻擊，攻擊30天后檢測肺組織培養(yǎng)帶菌量和肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，評(píng)價(jià)疫苗對動(dòng)物的免疫保護(hù)

10、性。小鼠肺組織培養(yǎng)帶菌量的比較發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組帶菌量均明顯低于pcDNA3.1(+)空白質(zhì)粒對照組，pclvgA,／CpG和pclvgA／Hsp60免疫組較其它各疫苗免疫組要低一些，且尤以pclvgA／CpG最為明顯。病理形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)：空白質(zhì)粒pcDNA3.1(+)免疫組主要表現(xiàn)為滲出性病變，鏡下可見肺泡隔明顯增寬，局部毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，并可見單核及漿細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見紅染的滲出物，肺泡上皮細(xì)胞增生，多灶性肺氣腫形成；而DNA疫苗實(shí)

11、驗(yàn)組未見明顯的滲出性病變，未見明顯中性粒細(xì)胞浸潤，可見局部肺泡壁和肺泡隔程度不同的略微增厚。應(yīng)用所構(gòu)建的DNA疫苗免疫組均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)效應(yīng)。 本研究結(jié)果表明：所構(gòu)建的嗜肺軍團(tuán)菌DNA疫苗具有較強(qiáng)的免疫原性和一定程度的免疫保護(hù)作用；pclvgA／CpG和pclvgA／Hsp60免疫組細(xì)胞免疫各項(xiàng)指標(biāo)高于其它免疫組。由于嗜肺軍團(tuán)菌為胞內(nèi)寄生菌，有效抵御和清除其感染細(xì)胞免疫起關(guān)鍵作用，基于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，pclvgA／Cp