泡桐叢枝植原體質(zhì)?；騪PaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4的功能分析.pdf

1、由植原體引起的泡桐叢枝病(PaWB)在我國分布廣泛，為害嚴重，是中國泡桐樹種上最嚴重的病害之一。泡桐叢枝病由種苗種根等無性繁殖材料和韌皮部取食的介體昆蟲傳播，目前已鑒定的介體昆蟲有茶翅蝽(Halyomorpha halys(St(a)gl))、煙草盲蝽(Crytopeltis tenuis(Reuter))和小綠葉蟬(Empoasca flavescens(Fabricius))。為了研究泡桐叢枝植原體質(zhì)粒的功能，進一步明確泡桐叢枝病介

2、體昆蟲-植原體之間的分子互作和介體昆蟲的傳播特性，本論文對以下四個方面進行研究。
　　 本研究從實驗室保存的含泡桐叢枝植原體質(zhì)粒pPaWBNy-1的3.0 kb的克隆和感病泡桐組培苗中分離到蟲傳相關基因pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4的親水性肽段編碼區(qū)，連接到原核表達載體。通過優(yōu)化表達條件，得到分子量約為15 kDa的His-ORF5和分子量約為38 kDa的GST-ORF4融合蛋白。純化融合蛋白，制備

3、了這兩個融合蛋白的兔抗體。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，制備的兩個抗體特異性好、靈敏度高，間接ELISA測定兩者的效價為1∶8100和1∶4096。
　　 利用制備的抗體，分析了pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4在不同材料的表達情況，發(fā)現(xiàn)在感病的泡桐組培苗和野外采集的感病泡桐中皆未檢測到兩基因的表達，而在飼毒的茶翅蝽中檢測到分子量約17 kDa的pPaWBNy-1-ORF5編碼蛋白和18 kDa的Pa

4、WBNy-2-ORF4編碼蛋白。推測pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4編碼蛋白參與介體昆蟲茶翅蝽傳播泡桐叢枝植原體。利用原核表達的His-ORF5融合蛋白微注射茶翅蝽，制備了可用于體內(nèi)分子互作的蛋白樣本。以純化的His-ORF5融合蛋白作為探針，用Far Western blot試驗在茶翅蝽胸腹部提取的蛋白中鑒定到分子量為52 kDa和36 kDa的兩個與pPaWBNy-1-ORF5編碼蛋白互作的茶翅蝽蛋白，而在

5、血淋巴提取的蛋白中鑒定到分子量為52 kDa的互作蛋白。對于這兩個蛋白序列的測定，將會有助于確定pPaWBNy-1-ORF5和pPaWBNy-2-ORF4編碼蛋白的功能，有助于進一步理解泡桐叢枝植原體與介體昆蟲茶翅蝽互作的分子機制。
　　 采集了北京中國林科院院內(nèi)泡桐林中的茶翅蝽，建立了北京茶翅蝽種群的穩(wěn)定飼養(yǎng)、飼毒和微注射的技術體系。使用網(wǎng)捕法和振落法采集了河南南陽泡桐林和越冬場所的蝽象，一共采集了四種蝽象:茶翅蝽、麻皮蝽(E

6、rhtesina fullo(Thunberg))、珀蝽(Plautiafimbriata(Fabricus))和寬脛格蝽(Cappaea tibialis Hsiao et Cheng)，它們的數(shù)量分別為293、41、8和8頭。對越冬場所和泡桐林中的蝽象樣本分別提取DNA和蛋白。巢式和半巢式PCR檢測帶毒情況，在麻皮蝽和寬脛格蝽中沒有檢測到植原體;而越冬茶翅蝽的帶毒率為29.2％，泡桐林中茶翅蝽的帶毒率為16.7％。提取的茶翅蝽蛋白進

7、行免疫印跡試驗，能夠檢測到分子量約17 kDa的pPaWBNy-1-ORF5編碼蛋白表達。
　　 使用質(zhì)?；騌epA的引物進行半巢式PCR檢測珀蝽中的植原體，發(fā)現(xiàn)一頭珀蝽檢測結果為陽性，對PCR產(chǎn)物克隆和測序，序列分析發(fā)現(xiàn)其與泡桐叢枝植原體的RepA同源性為99.4％。對陽性珀蝽的蛋白進行免疫印跡試驗，鑒定到一個分子量約18 kDa的pPaWBNy-2-ORF4編碼蛋白。以上結果證明該頭珀蝽攜帶泡桐叢枝植原體。珀蝽是否也是泡桐