家蠶細(xì)小病毒樣病毒VD2-ORF1基因的表達(dá)和分析.pdf

1、家蠶細(xì)小病毒樣病毒(Bombyx mori parvo-like virus china isolate,BmPLV)是首例動(dòng)物二分病毒,病毒粒子表面無(wú)囊膜包裹,衣殼呈二十面體對(duì)稱。BmPLV與細(xì)小病毒相比有三個(gè)顯著的特征:一是該病毒的基因組為兩個(gè)單鏈DNA分子(VD1,VD2),這兩種核酸分子以單鏈線型方式(+VD1、-VD1、+VD2、-VD2)被分別包埋在各自的衣殼蛋白中；二是VD1和VD2末端擁有53 nt的共有序列,并且其末端

2、的反向重復(fù)序列不形成回文結(jié)構(gòu)；三是基因組具有編碼DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)域。病毒結(jié)構(gòu)蛋白的性質(zhì)和組成決定了病毒衣殼結(jié)構(gòu)及病毒粒子侵染特性,部分結(jié)構(gòu)蛋白還能參與到病毒基因組的復(fù)制中。
　　 家蠶細(xì)小病毒樣病毒中國(guó)株(BmPLV-Z)VD2-ORF1,由3483 nt組成,編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,理論分子量為133 kDa,我們將其命名為P133。在細(xì)小病毒中,編碼能力較強(qiáng)的衣殼蛋白基因會(huì)通過(guò)漏掃描或可變剪接等方式來(lái)產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)蛋白,而不會(huì)直

3、接產(chǎn)生分子量如133 kDa般大的結(jié)構(gòu)蛋白。為了鑒定VD2-ORF1編碼133 kDa的結(jié)構(gòu)蛋白和了解P133在宿主細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相,本研究通過(guò)對(duì)VD2-OR目的3’末端933bp和5’末端1020 bp進(jìn)行了克隆表達(dá),并制備了P133N與P133C多克隆抗體,利用該抗體檢測(cè)了病毒粒子中的結(jié)構(gòu)蛋白P133,并對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白P133在宿主體內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了研究,取得的研究成果如下:
　　 1.P133氨基酸序列分析及相似性比對(duì)

4、>　　 通過(guò)NCBI Blastp軟件,搜索結(jié)構(gòu)蛋白P133相似性序列,結(jié)果顯示,有六條同源序列,這六條同源序列均來(lái)自于呼腸孤病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。多序列比對(duì)結(jié)果顯示,P133蛋白與這六種病毒的結(jié)構(gòu)蛋白C端是具有相似性,而這些結(jié)構(gòu)蛋白的C端都具有一些功能結(jié)構(gòu)域,如CoCPV VP3的DNA結(jié)合序列。同時(shí),絲氨酸蛋白酶與銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的C末端也與P133的C端有相似性。
　　 2.P133 C端與N端的原核表達(dá)與多克隆抗體的制備
　

5、　 構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-P133N和pET-28a-P133C,轉(zhuǎn)化E.coli BL21菌株,利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。Western blot與質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示,成功表達(dá)了家蠶細(xì)小病毒樣病毒中國(guó)株(BmPLV-Z)P133的C端340 aa及N端311 aa的融合多肽。Ni-NTA純化融合蛋白,分別制備了P133C和P133N多克隆抗體。
　　 3.病毒粒子中結(jié)構(gòu)蛋白P133的鑒定
　　 分離純化B

6、mPLV-Z病毒粒子,SDS-PAGE分離病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白,利用制備的P133C和P133N抗體分別對(duì)病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行western blot分析。結(jié)果顯示,這兩種抗體在病毒粒子結(jié)構(gòu)多肽中識(shí)別的蛋白條帶大小相同,約133 kDa,證實(shí)P133確是病毒VD2-ORF1編碼的結(jié)構(gòu)蛋白；并且表明VD2-ORF1編碼單一的結(jié)構(gòu)蛋白。
　　 4.病毒結(jié)構(gòu)蛋白在中腸組織中的表達(dá)鑒定.
　　 以感染病毒不同時(shí)間點(diǎn)的家蠶中腸組織為樣