內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛臨床型子宮內(nèi)膜炎致病葡萄球菌超抗原基因分布、耐藥性及分型研究.pdf

1、臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后常見的產(chǎn)科疾病，可導(dǎo)致奶牛繁殖能力下降甚至不孕癥的發(fā)生。內(nèi)蒙古自治區(qū)是奶牛養(yǎng)殖大省，奶牛存欄量居全國前列，但該病給本地區(qū)奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。葡萄球菌是引起該病發(fā)生的主要條件性病原菌之一，其產(chǎn)生的超抗原毒素與炎性疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。治療由致病葡萄球菌引起的獸醫(yī)臨床感染疾病通常采用抗菌藥物療法，但由于奶牛場獸醫(yī)臨床普遍存在抗菌藥物不合理使用現(xiàn)象，導(dǎo)致奶牛源致病葡萄球菌產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的耐藥性。因

2、此，開展奶牛源致病葡萄球菌的抗菌藥物耐藥性調(diào)查和監(jiān)控研究，對(duì)了解和闡明其耐藥性的產(chǎn)生機(jī)理和流行擴(kuò)散現(xiàn)狀具有重要意義。此外，治療奶牛細(xì)菌感染性疾病時(shí)，由于不同地區(qū)，不同養(yǎng)殖場在抗菌藥物的選擇和使用方面存在差異，造成奶牛源致病葡萄球菌的耐藥特點(diǎn)也存在地區(qū)性差異。因此，開展不同地區(qū)奶牛源致病葡萄球菌耐藥現(xiàn)狀調(diào)查研究，可為不同地區(qū)奶牛場治療由致病葡萄球菌引起的感染性疾病抗菌藥物的選用提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過開展內(nèi)蒙古地區(qū)臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄

3、球菌的種群分布及超抗原毒力基因在菌株中的流行、分布情況調(diào)查，探討葡萄球菌在該病發(fā)生、發(fā)展過程中潛在的致病作用;在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展臨床分離葡萄球菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥表型和分子耐藥機(jī)理研究，考察內(nèi)蒙古不同地區(qū)奶牛源葡萄球菌的耐藥現(xiàn)狀和耐藥性產(chǎn)生的原因，可為獸醫(yī)臨床科學(xué)、合理的治療該病提供用藥方案;此外，通過開展內(nèi)蒙古地區(qū)臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎金黃色葡萄球菌的spa基因分型研究，闡明內(nèi)蒙古不同地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌中主要流行的spa基因型

4、別及是否存在流行病學(xué)相關(guān)性，可為篩選本地區(qū)金黃色葡萄球菌疫苗候選菌株和控制由金葡菌引起的奶牛感染性疾病奠定理論基礎(chǔ)。
　　(1)采用常規(guī)細(xì)菌分離方法和gap基因PCR及測序法對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎病料中的葡萄球菌進(jìn)行了分離和種水平鑒定。結(jié)果表明，從采集自內(nèi)蒙古不同地區(qū)的260份病料中，共分離到127株10種不同的葡萄球菌，分離率為48.8％。其中金黃色葡萄球菌53株，凝固酶陰性葡萄球菌74株。各地區(qū)葡萄球菌，金黃色葡萄球

5、菌和凝固酶陰性葡萄球菌的分離率差異均不顯著(p＞0.05)。分離到的凝固酶陰性葡萄球菌共9種，其中腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）數(shù)量最多（38株/29.9％），其次為產(chǎn)色葡萄球菌（S.chromogenes）（22株/17.3％）。
　　(2)采用PCR技術(shù)對(duì)臨床分離菌種中15種超抗原基因的攜帶情況進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果表明，除腸毒素基因see和seg檢測結(jié)果為陰性外，其余基因均不同程度的分布于金葡菌和凝固酶陰性葡萄球菌

6、中。其中新型腸毒素基因selj(49株/38.6％)檢出率最高，其次為seln(39株/30.7％)和傳統(tǒng)型腸毒素基因sec(27株/1.3％)基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)17種不同的超抗原毒力基因組合，攜帶sec+ selj+seln基因型的菌株最為流行（21株/16.5％）。西部地區(qū)凝固酶陰性葡萄球菌的超抗原基因攜帶率顯著高于中部地區(qū)(p＜0.05)。
　　(3)采用微量肉湯稀釋法測定了19種獸醫(yī)臨床常的抗菌藥物及組合對(duì)臨床分離菌的MIC。

7、結(jié)果顯示，分離菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率在57.6％～79.5％;對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥率在40％～50％之間;分離菌對(duì)慶大霉素和3組抗菌藥物組合的敏感性相對(duì)較高，耐藥率僅為15％左右，所有菌株對(duì)萬古霉素均敏感。共發(fā)現(xiàn)43株多重耐藥菌(33.9％)。不同地區(qū)的分離菌株對(duì)氟喹諾酮類藥物、克林霉素和慶大霉素的耐藥率存在地區(qū)差異(p＜0.05或p＜0.01)。采用PCR法對(duì)紅霉素、四環(huán)素和青霉素耐藥菌株進(jìn)行了分子耐藥機(jī)理的

8、研究。結(jié)果表明，由erm基因介導(dǎo)的紅霉素作用靶點(diǎn)甲基化是本地區(qū)奶牛源葡萄球菌對(duì)紅霉素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制;由tetK基因介導(dǎo)的外排機(jī)制是四環(huán)素耐藥菌產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制;由blaZ基因介導(dǎo)的水解作用是引起該地區(qū)青霉素耐藥菌株產(chǎn)生的主要分子機(jī)制。
　　(4)采用頭孢西丁紙片法和mecA基因PCR技術(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行了甲氧西林耐藥菌的篩選。結(jié)果表明，有22株凝固酶陰性葡萄球菌被鑒定為甲氧西林耐藥葡萄球菌，未發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。采

9、用多重PCR法對(duì)22株甲氧西林耐藥葡萄球菌進(jìn)行了SCCmec分型試驗(yàn)。結(jié)果顯示，有20株菌被成功的分為3個(gè)型，分別為Ⅱ型（6株，13.6％），Ⅲ型（12株，54.5％），Ⅳa型（2株，9.1％），有2株未能分型。內(nèi)蒙古中部和西部地區(qū)MRS菌株中以Ⅲ型SCCmec為主，東部地區(qū)以Ⅳa型為主。Ⅱ和Ⅲ型SCCmec的MRS菌株在中部，西部和東部地區(qū)的中均有分布。22株甲氧西林耐藥葡萄球菌均為多重耐藥茵，其對(duì)青霉素、氨芐西林、克拉霉素和紅霉素的

10、耐藥率極顯著高于甲氧西林敏感葡萄球菌(p＜0.01)，對(duì)頭孢噻肟的耐藥率顯著高于甲氧西林敏感葡萄球菌(p＜0.05）。
　　(5)采用PCR法對(duì)53株臨床分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了spa基因分型試驗(yàn)。結(jié)果表明，有51株菌被分為10個(gè)不同的型別，2株菌未能分型。其中t518型菌株最流行(34.0％)，其次為t189型(20.8％)。t518型金黃色葡萄球菌的分布最廣泛，在5個(gè)不同地理區(qū)域的采樣地點(diǎn)均有流行，其余型別的SA在1～3個(gè)采

11、樣點(diǎn)內(nèi)分布。
　　本研究得到的主要結(jié)論如下:
　　(1)內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛臨床型子宮內(nèi)膜炎病料中，葡萄球菌分離率較高，且種群分布廣泛，是引起本地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生的主要病原菌之一。
　　(2)多種超抗原毒力基因基因廣泛地分布于內(nèi)蒙古地區(qū)臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎不同種葡萄球菌中，且不同地區(qū)葡萄球菌中超抗原毒力基因的流行模式存在差異。
　　(3)內(nèi)蒙古地區(qū)臨床型奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌對(duì)獸醫(yī)臨床藥用抗菌藥物產(chǎn)生了較強(qiáng)的耐藥性