奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的16S rRNA序列鑒定及金黃色葡萄球菌血漿凝固酶的原核表達(dá).pdf

1、奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛的主要疾病之一，主要是由病原微生物的感染引起，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，缺少針對(duì)引起奶牛子宮內(nèi)膜炎炎的主要病原菌的準(zhǔn)確而快速的檢測方法；尤其對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌缺少分子流行病學(xué)資料，國內(nèi)外還缺少預(yù)防奶牛子宮內(nèi)膜炎效果較好的疫苗，我國眾多奶牛散養(yǎng)戶在頑固性子宮內(nèi)膜炎面前束手無策等等，為探討、解決以上問題，進(jìn)行了本項(xiàng)研究。本研究分為兩個(gè)部分： 第一部分：奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定對(duì)山東省濟(jì)

2、南、泰安兩個(gè)地區(qū)子宮內(nèi)膜炎的患牛采樣并進(jìn)行致病菌的分離鑒定。首先進(jìn)行細(xì)菌的常規(guī)分離、純化、培養(yǎng)并大致進(jìn)行分類。本試驗(yàn)利用16SrRNA結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，根據(jù)外文資料，選用特異性的引物，利用PCR方法擴(kuò)增未知菌株的16SrRNA基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接構(gòu)建克隆載體，經(jīng)PER和雙酶切正確后測序，并將其結(jié)果與GeneBank中的收錄菌進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病菌有：SD01為瓊氏不動(dòng)桿菌；SD02為糞腸球菌；

3、SD03為金黃色葡萄球菌：SD04為中間葡萄球菌；SD05為溶血葡萄球菌；SD06為魯菲不動(dòng)桿菌；SD07為無乳鏈球菌；SD08為芽孢桿菌：SD09為枯草芽孢桿菌；SD10為大腸桿菌；SD11為假單胞桿菌。通過國際公認(rèn)的16SrRNA序列鑒定技術(shù)成功準(zhǔn)確鑒定引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病菌的種類，這對(duì)于奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治具有重要的指導(dǎo)意義。 第二部分：金黃色葡萄球菌血漿凝固酶基因的原核表達(dá)及生物活性分析血漿凝固酶(coagulase

4、，coa)是金黃色葡萄球菌的主要毒力因子之一，該基因含有一個(gè)ORF，全長2106bp，共編碼701個(gè)氨基酸。利用PCR技術(shù)從金黃色葡萄球菌臨床分離株的全基因組擴(kuò)增出編碼血漿凝固酶的基因，經(jīng)克隆篩選和測序鑒定后，構(gòu)建成該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a+/coa，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明：coa基因在大腸桿菌中已融合表達(dá)，融合蛋白的分子量為100KD。血漿凝固試驗(yàn)證明該融合蛋白具有凝固血漿的作用，其效價(jià)達(dá)0.012m