金黃色葡萄球菌rAtlM、rAtlG的原核表達及體內(nèi)外抗菌效應(yīng)初步探討.pdf

1、目的:
　　 金黃色葡萄球菌是引起人和動物化膿性感染的重要病原體，可引起局部化膿感染，也可引起敗血癥、膿毒血癥等全身感染?？股氐念l繁使用加劇了金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)象尤其是多重耐藥，現(xiàn)有抗生素已經(jīng)不足以治愈金黃色葡萄球菌引起的感染，尋找新型抗菌藥物成為研究熱點。
　　 金黃色葡萄球菌的自溶素(AtlA)是一個雙功能蛋白，經(jīng)過蛋白酶作用可分解為51kD的氨基葡萄糖苷酶（glucosaminidase，AtlG）和62kD的

2、酰胺酶(amidase，AtlM)。本研究通過基因工程技術(shù)獲取金黃色葡萄球菌(ATCC25923)自溶素(autolysin，Atl)的兩個功能片段AtlM和AtlG重組蛋白，并初步探討其在體內(nèi)、體外的抗菌作用，為自溶素作為抗菌藥物的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.獲取rAtlM和rAtlG:根據(jù)GenBank中金黃色葡萄球菌自溶素的基因序列(AC:D17366)設(shè)計合成兩對特異的引物，采用PCR技術(shù)以ATC

3、C25923的基因組為模板擴增相應(yīng)的atlM、atlG序列，分別構(gòu)建克隆質(zhì)粒及表達質(zhì)粒;經(jīng)由IPTG誘導表達重組蛋白rAtlM、rAtlG，通過透析袋電洗脫的方法純化并測定其濃度。
　　 2.體外抑菌試驗:采用微量肉湯稀釋法測定rAtlM和rAtlG對標準菌株/耐藥菌株的MIC。用0.01MPBS(pH7.0)混懸金黃色葡萄球菌（終濃度為5×105CFU/ml），并加入rAtlM/rAtlG(終濃度為50μg/ml)，測定1h、

4、3h、5h時間點rAtlM及rAtlG對細菌生長的抑制作用及差異。
　　 3.體內(nèi)（小鼠）抑菌試驗:以金黃色葡萄球菌標準株及苯唑西林耐藥株分別對小鼠行腹腔接種（菌液濃度107CFU/ml，接種0.5ml），1h后再依次給每組小鼠尾靜脈注射rAtlM或rAtlG0.2ml(蛋白量1mg/只)，對照組接種0.2ml無菌N.S。2h和4h后每只小鼠眼球采血10μl加入血培養(yǎng)瓶，最終以平板菌落計數(shù)測定金黃色葡萄球菌及其耐藥株對rAtlM

5、及rAtlG的藥物敏感性，判斷比較重組蛋白AtlM和AtlG的抗菌活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建了原核表達載體pET-32a(+)/atlM和pET-32a(+)/atlG，表達的重組蛋白AtlM、AtlG經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒定符合預(yù)期結(jié)果，約為80kD和66kD，經(jīng)微量紫外分光光度計測得濃度為1.25mg/ml和1.63mg/ml。
　　 2.rAtlM對金黃色葡萄球菌及其耐藥株的MIC分別為1

6、6μg/ml和64μg/ml;rAtlG對金黃色葡萄球菌及其耐藥株的MIC分別為8μg/ml和64μg/ml。體外抑菌試驗顯示，rAtlM、rAtlG對金黃色葡萄球菌及其苯唑西林耐藥株均有一定的抑菌作用（3h測定點rAtlM作用于標準株和耐藥株的p值分別為0.004，0.001;3h測定點rAtlG作用于標準株和耐藥株的p值分別為0.004、0.003）;3h和5h測定點，rAtlM對耐藥株的抑菌效果優(yōu)于rAtlG（p值分別為0.001