金黃色葡萄球菌耐藥突變選擇窗的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：建立防耐藥變異濃度(MutantPreventionConcentration，MPC)體外測定方法，并測定氟喹諾酮類(FQ)藥物莫西沙星、加替沙星、帕珠沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC25923同源耐藥突變株及臨床分離金黃色葡萄球菌的MPC和耐藥突變選擇窗(MutantSelectionWindow，MSW)，結(jié)合已有的藥代動力學(xué)參數(shù)，評價不同F(xiàn)Q藥物的MSW大小及抑制耐藥突變株選擇的能力。

2、同時觀察FQ藥物濃度對耐藥突變株恢復(fù)生長和耐藥突變位點(diǎn)選擇的影響。在以上體外實(shí)驗的基礎(chǔ)上，以左氧氟沙星-金黃色葡萄球菌ATCC25923為例，從動物體內(nèi)水平初步驗證MSW理論，找出能夠預(yù)測耐藥突變株在體內(nèi)選擇性富集的藥代、藥效動力學(xué)(PK/PD)參數(shù)。進(jìn)一步通過分離結(jié)核患者前鼻腔攜帶的利福平敏感的金黃色葡萄球菌在應(yīng)用含利福平的聯(lián)合化療方案治療后轉(zhuǎn)為對利福平耐藥的菌株，從臨床水平初步驗證MSW理論。 方法：(1)肉湯法富集1010

3、cfu/ml金黃色葡萄球菌，采用瓊脂平板稀釋法測定FQ藥物對金黃色葡萄球菌不同菌株的MIC、MIC99、MPC和耐藥突變菌恢復(fù)生長菌落數(shù)，并通過對grlA和gyrA的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)的PCR擴(kuò)增和測序，明確不同F(xiàn)Q藥物濃度對耐藥突變位點(diǎn)的影響。(2)建立兔組織籠金黃色葡萄球菌ATCC25923感染模型，通過灌胃方法分別給予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg和40mg/kg左氧氟沙星治

4、療，使組織籠內(nèi)藥物濃度分別低于MIC99、位于MIC99和MPC之間(MSW內(nèi))、高于MPC及在治療過程中藥物濃度有不同時間跨MSW，對照組應(yīng)用生理鹽水灌胃。觀察組織籠內(nèi)細(xì)菌耐藥突變株的選擇和MIC變化情況，并采用液相色譜法測定組織液內(nèi)左氧氟沙星濃度。分析組織籠內(nèi)左氧氟沙星濃度與出現(xiàn)耐藥的關(guān)系。(3)篩選鼻腔攜帶金黃色葡萄球菌的結(jié)核病患者，觀察含利福平的聯(lián)合化療方案治療前后金黃色葡萄球菌對利福平的藥敏變化，分離由治療前利福平敏感轉(zhuǎn)為治療

5、后耐藥的金黃色葡萄球菌菌株。通過spa和PFGE分型，確定治療前后分離菌株同源性。(4)通過紙片法測定前鼻腔分離的所有金黃色葡萄球菌的藥敏特性。 結(jié)果：第一部分：(1)莫西沙星、加替沙星、帕珠沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星對金黃色葡萄球菌ATCC25923的MPC分別為0.18、0.3、0.75、0.8和1.8μg/ml，選擇指數(shù)(SI)分別為9.0、7.5、8.0、8.3和10.6。(2)FQ藥物濃度對金黃色葡萄球菌耐藥突變株恢復(fù)

6、生長菌落數(shù)和耐藥位點(diǎn)的選擇有明顯的影響。(3)對于金黃色葡萄球菌ATCC25923的同源耐藥突變株，加替沙星和莫西沙星對第一步耐藥突變株的MPC明顯低于環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和帕珠沙星。第一步耐藥突變株的MSW較ATCC25923的MSW明顯增寬，以帕珠沙星最為明顯。第二步耐藥突變株對加替沙星和莫西沙星仍然敏感，但MPC高達(dá)8～16μg/ml。(4)莫西沙星、加替沙星、帕珠沙星和環(huán)丙沙星對42株環(huán)丙沙星敏感的金黃色葡萄球菌臨床分離菌的MP

7、C90值分別為0.5μg/ml、0.5μg/ml、4μg/ml和8μg/ml。SI分別為4、4、16和16。莫西沙星和加替沙星對12株環(huán)丙沙星耐藥的金黃色葡萄球菌臨床分離菌的MPC90均為16μg/ml，而MPC90/MIC90比值均為8。 第二部分：(1)動物體內(nèi)實(shí)驗表明，當(dāng)左氧氟沙星組織液濃度位于MSW內(nèi)時，容易導(dǎo)致ATCC25923耐藥突變株的選擇，而藥物濃度位于MSW外時，不會出現(xiàn)耐藥突變株的選擇。(2)當(dāng)左氧氟沙星組織

8、液濃度位于MSW內(nèi)的下半部時，最容易導(dǎo)致耐藥突變株的選擇。(3)當(dāng)使組織籠內(nèi)左氧氟沙星濃度高于MPC的時間占整個治療時間的百分比T＞MPC(％)保持在16.7％以上時，可有效地防止ATCC25923耐藥突變株在體內(nèi)的選擇性富集擴(kuò)增；當(dāng)左氧氟沙星組織液Cmax高于MIC99但又不能超過MPC時，藥物濃度在MSW內(nèi)的時間占整個治療時間的百分比Tmsw(％)超過16.7％，就可導(dǎo)致耐藥突變株在體內(nèi)的選擇性富集擴(kuò)增；而當(dāng)藥物濃度在整個用藥期間均

9、低于MIC99時，不會導(dǎo)致耐藥突變株的選擇性富集。(4)當(dāng)組織籠內(nèi)左氧氟沙星Cmax/MIC≥8，或AUC0-24/MIC＞250或AUC0-24/MPC＞40時，可有效防止耐藥的發(fā)生。 第三部分：(1)結(jié)核患者前鼻腔金黃色葡萄球菌攜帶率為16.9％。在入選的58例患者中，治療4周時的細(xì)菌清除率為91.4％，5例仍然有前鼻腔定植的患者，其定植菌株均為RFP耐藥菌株，耐藥發(fā)生率為8.6％。spa和PFGE分型表明治療前后分離的菌株

10、為同一型。(2)對照組糖尿病患者前鼻腔金黃色葡萄球菌攜帶率為20.5％，觀察期間無耐藥株出現(xiàn)。 第四部分結(jié)核病和糖尿病患者前鼻腔所攜帶的金黃色葡萄球菌對青霉素和紅霉素以外的多數(shù)抗菌藥物敏感。 結(jié)論：(1)對于金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC25923同源耐藥突變株及臨床分離的金黃色葡萄球菌，莫西沙星和加替沙星限制下一步耐藥突變株選擇的能力優(yōu)于帕珠沙星、左氧氟沙星和環(huán)丙沙星。(2)FQ藥物濃度對金黃色葡萄球菌耐藥

11、突變株恢復(fù)生長菌落數(shù)和耐藥位點(diǎn)的選擇都有明顯的影響。(3)結(jié)合藥代動力學(xué)參數(shù)，對于環(huán)丙沙星或左氧氟沙星耐藥的金黃色葡萄球菌，莫西沙星和加替沙星不能限制下一步耐藥突變株的選擇。(4)從動物體內(nèi)水平證明當(dāng)組織籠內(nèi)左氧氟沙星濃度高于MPC時，不會出現(xiàn)耐藥突變株的選擇性富集；當(dāng)藥物濃度低于MIC99時，也不會導(dǎo)致耐藥突變株的選擇性富集；當(dāng)藥物Cmax不能達(dá)到MPC，并且大部分時間位于MSW內(nèi)時，很容易導(dǎo)致耐藥突變株的體內(nèi)選擇并導(dǎo)致耐藥。(5)體