金黃色葡萄球菌Fe攝取調(diào)節(jié)蛋白SirA的原核表達及其功能的初步研究.pdf

1、揚州大學(xué)碩士學(xué)位論文金黃色葡萄球菌Fe攝取調(diào)節(jié)蛋白SirA的原核表達及其功能的初步研究姓名：舒燕申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：朱國強201106揚州人學(xué)碩學(xué)位論文II一質(zhì)膜外部能夠捕獲結(jié)合了鐵的鐵載體。本試驗擬以sirABC操縱子編碼的SirA蛋白與鐵載體的結(jié)合為研究對象，通過PCR擴增出＆aureus基因組DNA中sirA基因，對該基因片段進行回收，將其連接到pColdTMTF冷凍表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)

2、感受態(tài)細胞，通過IPTG誘導(dǎo)表達SirATF重組蛋白，采用蛋白純化試劑盒對其進行純化后測定重組蛋白濃度，免疫ICR小鼠制備SirATF重組蛋白多抗血清，應(yīng)用問接ELISA方法測定免疫鼠血清抗體效價；用WesternBlot檢測含不同鐵離子濃度培養(yǎng)條件下SirA蛋白的表達情況；分別用純化的SirA蛋白、滅活的Saureus菌體和無菌PBS溶液免疫小鼠，共三次免疫，在第三免7天后，分別用101、108、109CFU的活金葡菌進行小鼠鼻腔定植

3、，定植七天后處死小鼠，剪下鼻腔組織進行鼻腔活菌總數(shù)測定。設(shè)計了試驗探討SirA多抗血清對Saureus生長的影響和sirA在Saureus致病過程中的作用。實驗結(jié)果表明，成功擴增出sirA基因并將其連到表達載體pColdTMTF中。SDSPAGE結(jié)果表明重組質(zhì)粒pColdTMTFsirA能夠在EcolfBL21(DE3)@成功誘導(dǎo)和高效表達，且表達的重組蛋白是可溶性的。用重組蛋白免疫小鼠后制備的多抗血清抗體水平在加強免疫第二周達到1：6

4、4000；WestemBlot檢測表明，當(dāng)金黃色葡萄菌在鐵限制性培養(yǎng)條件下(大豆胰蛋白胨肉湯600“M22聯(lián)吡啶)SirA蛋白量表達比在富鐵培養(yǎng)下培養(yǎng)(大豆胰蛋白胨肉湯50州FeCl3)要高。鼻腔定植試驗結(jié)果表明，小鼠在三免后7天，SirA蛋白免疫組(228333士41186)對Saureus的粘附阻斷能力優(yōu)于滅活Saureus免疫組(4420002140897)(P005)，并且顯著高于PBS對照組(1020333士129693)(P

5、001)；在第十四天，SirA蛋白免疫組(61000110535)對Saureus的粘附阻斷能力優(yōu)于PBS對照組(168333土36746)(P001)?？贵w抑制試驗表明，在缺鐵條件下不同稀釋的SirA多抗能夠有效的降低Saureus的生長，而在富鐵條件下此種作用效果不如在缺鐵培養(yǎng)下明顯。綜上所述，sirA基因在pColdTMTF冷凍表達載體中能夠大量表達可溶性重組蛋白，且表達的重組SirA蛋白具有較好的免疫原性及免疫保護作用，為將來成