金黃色葡萄球菌TRAP蛋白及VraX蛋白的生物學功能研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，金葡菌)是一種常見的革蘭氏陽性致病菌，廣泛分布于自然界中，通過飛沫、接觸等途徑傳播并引起多種疾病。當金葡菌侵入機體時，機體會通過補體系統(tǒng)、吞噬細胞、不飽和脂肪酸等多種防御系統(tǒng)清除入侵細菌。同時金葡菌自身在感染機體的過程中，也會表達多種分子對抗機體的清除作用。近年來由于抗生素濫用，導致了多種耐藥性金葡菌的出現(xiàn)，耐藥金葡菌引發(fā)的感染是臨床面臨的棘手難題。
　　本論文主要針對以

2、下兩個內(nèi)容展開了相關的研究，具體如下:①TRAP蛋白參與長鏈不飽和脂肪酸殺傷金葡菌的機制研究;②假定蛋白VraX參與金葡菌天然耐藥的機制研究。
　　本研究的第一部分為TRAP蛋白參與長鏈不飽和脂肪酸殺傷金黃色葡萄球菌的機制研究。長鏈不飽和脂肪酸一般指≥C16，含有一個以上雙鍵的脂肪酸。相關研究表明，該類脂肪酸是天然免疫系統(tǒng)中重要的組成成分，具有抗金葡菌感染的能力。TRAP是金葡菌致病性相關的蛋白分子，目前關于它的生物學功能存在爭議

3、，其確切功能尚不清楚。該部分內(nèi)容具體如下:
　　1.△trap對亞油酸的敏感性檢測:我們實驗室前期通過基因同源重組的方法獲得了traP基因的缺失突變株(△traP)，當其與亞油酸進行共孵育培養(yǎng)時，與野生型菌株相比，其存活率明顯降低。通過基因芯片對比分析我們發(fā)現(xiàn)在△traP中與脂代謝相關聯(lián)的基因fadD的mRNA水平明顯降低。
　　2.△fadD對亞油酸的敏感性檢測:我們通過基因同源重組的方法獲得了fadD基因缺失突變株（△f

4、adD）。進一步的實驗結果發(fā)現(xiàn)，△fadD對亞油酸敏感性也明顯增強。我們在△traP中回復fadD的水平，但其對亞油酸的敏感性未得到回復。
　　3.TRAP蛋白通過與FadD蛋白相互作用參與亞油酸殺傷金葡菌的過程:通過免疫共沉淀實驗及質譜鑒定的方法，我們發(fā)現(xiàn)FadB和FadD可能是TRAP的結合蛋白。進一步的ELISA實驗結果表明只有FadD蛋白能夠特異與TRAP蛋白結合。這表明TRAP蛋白通過與FadD蛋白相互作是其影響亞油酸對

5、金葡菌殺傷的主要機制。
　　本論文的第二部分為假定蛋白VraX參與金黃色葡萄球菌天然耐藥的機制研究。天然耐藥是指在抗生素作用下，抗生素敏感細菌中的一部分可以存活和繁殖，成為接收外來耐藥基因的載體。研究表明抗生素作用下，金葡菌中的多種分子異常表達對抗藥物的殺傷作用。通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，多種抗生素處理后金葡菌假定蛋白VraX的水平明顯升高（＞20倍）。本部分研究中，我們主要探索VraX參與金葡菌天然耐藥的機制研究，具體內(nèi)容如下:

6、　　1.VraX蛋白與金葡菌的天然耐藥明顯相關:我們通過基因同源重組的方法獲得了vraX基因的缺失突變株(△vraX)。藥物敏感性檢測實驗結果表明△vraX對多種抗生素敏感。
　　2.RNaseⅢ調(diào)控金葡菌中vraX的水平:我們通過RNA-pulldown實驗中證實RNaseⅢ能夠結合vraX，基因芯片對比分析發(fā)現(xiàn)△RNaseⅢ中vraX的水平明顯升高，我們利用RT-PCR及qRT-PCR驗證這一結果。進一步的凝膠阻滯實驗證實RN

7、aseⅢ可以特異的結合vraX。同時降解實驗表明，在Mg2+存在的條件下vraX可以被RNaseⅢ特異的降解。我們的結果提示RNaseⅢ能夠結合并降解vraX。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)金葡菌中的TRAP蛋白可以通過與FadD蛋白相互作用參與亞油酸對金葡菌的殺傷。同時，我們的研究結果表明VraX蛋白可能參與了金葡菌的天然耐藥，并且RNaseⅢ可以影響其水平。以上研究將為抗金葡菌感染研究提供可能的藥物靶點以及新的理論基礎。