金黃色葡萄球菌L-乳酸脫氫酶生物學功能研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種能造成嚴重社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的致病菌，它不僅可以引起皮膚粘膜膿腫、中耳炎等常見感染,還可以引起腦膜炎和菌血癥等嚴重感染。金黃色葡萄球菌引發(fā)感染的發(fā)病率呈上升趨勢，耐藥問題日益嚴重，這已經(jīng)引起了人們的高度重視。乳酸脫氫酶（ lactate dehydrogenase，LDH）催化丙酮酸和乳酸之間的相互轉化,它對于金黃色葡萄球菌保持毒力、逃避宿主的先天性免

2、疫以及生物膜形成是至關重要的。因此，本研究在前期對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌L-乳酸脫氫酶的克隆、表達的基礎上，制備多克隆抗體，分析其免疫活性及交叉反應性，并進一步分析了該多克隆抗體對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響,為其后續(xù)診斷、治療研究奠定基礎。
　　方法：
　　復蘇pET28a-ldh1/Bl21重組菌，提取pET28a-ldh1重組質粒進行雙酶切鑒定。IPTG誘導重組融合蛋白表達、以抗His標簽的單克隆抗體進行免疫印跡法

3、（Western-blot）鑒定重組蛋白。以IPTG誘導后，溶菌酶以及超聲裂解后收集上清，Ni2+柱純化蛋白。透析和濃縮純化蛋白后分析其酶活性和理化性質。使用純化的重組蛋白以及相應的佐劑免疫小鼠，收集小鼠抗血清，利用ELISA測定血清抗體效價。以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，使用小鼠抗血清進行免疫印跡法鑒定重組蛋白的免疫反應性。收集金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌以及重組

4、菌，經(jīng)溶菌酶和超聲破裂后離心取上清進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后進行Western-blot鑒定L-乳酸脫氫酶多克隆抗體的交叉反應性。最后以結晶紫為染料，30％的醋酸為脫色劑，于570 nm波長下測定吸光值，進一步分析該多克隆抗體對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響。
　　結果：
　　重組質粒pET28a-ldh1雙酶切后獲得大小約950 bp的目的條帶，誘導表達后SDS-PAGE電泳在約39 KDa處可見目的條帶，免疫

5、印跡法驗證了重組L-LDH的表達。Ni2+柱純化后獲得2.8 mg重組蛋白，酶活性為14100 U/L，三級結構預測該重組蛋白為四聚體。純化蛋白免疫小鼠能誘導產(chǎn)生特異性體液免疫應答， ELISA檢測特異性IgG效價，小鼠抗血清效價達1:50000。Western-blot鑒定顯示所制備的多克隆抗血清能分別識別金黃色葡萄球菌重組及天然L-乳酸脫氫酶，但不識別表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌、大腸埃希菌中天然乳酸脫氫酶。生物膜形成抑制實驗

6、顯示該多克隆抗體在稀釋倍數(shù)為1:1000時抑制率為66.4%，在稀釋倍數(shù)為1:2000時的抑制率為41.4%，在稀釋倍數(shù)為1:4000時的抑制率為16.2%。
　　結論：
　　純化的L-LDH具有良好的免疫活性，免疫小鼠獲得高滴度的多克隆抗體。使用 Western-blot鑒定顯示該多克隆抗體具有很好的特異性。并且該多克隆抗體對金黃色葡萄球菌生物膜形成具有一定的抑制作用。為后續(xù)使用該重組蛋白進行金黃色葡萄球菌感染的診斷和防治