金黃色葡萄球菌一氧化氮自由基誘導(dǎo)乳酸脫氫酶晶體結(jié)構(gòu)解析和酶活性研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是最常見的革蘭陽性致病菌，可以引起人體種類眾多的感染。而且，隨著抗生素的廣泛使用，耐藥性問題越來越嚴(yán)重。萬古霉素作為治療耐藥金黃色葡萄球菌感染的最后一道防線，也出現(xiàn)了敏感性降低，甚至完全耐藥的現(xiàn)象。其實(shí)，人類的自身先天免疫系統(tǒng)是有效抗擊外來微生物入侵的第一道防線。其中一種重要的機(jī)制就是誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶系統(tǒng)，其所合成的NO*可以直接抑制微生物的有氧呼吸能量代謝，并抑制微生物的

2、DNA復(fù)制。而金黃色葡萄球菌區(qū)別于其他非致病性葡萄球菌的一個(gè)主要特征，就是可以抵抗NO*的毒性，在外源性NO*壓力下仍能生長(zhǎng)和繁殖。其NO*解毒機(jī)制一方面與黃素血紅蛋白（hmp SACOL0220）行使的NO*雙氧化酶功能有關(guān)，可以將毒性NO*轉(zhuǎn)化為無毒的硝酸；另一方面與hmp同處于一個(gè)操縱子中的金黃色葡萄球菌乳酸脫氫酶-1（ldh-1 SACOL022）的誘導(dǎo)高表達(dá)密切相關(guān)。ldh-1與金黃色葡萄球菌中持續(xù)表達(dá)的同功酶ldh-2可以改

3、變金黃色葡萄球菌在NO*生存環(huán)境下細(xì)菌的能量代謝途徑，從而使金黃色葡萄球菌可以在NO*環(huán)境壓力下正常生長(zhǎng)和繁殖。 研究思路：理論上ldh-1蛋白可以作為一個(gè)抗金黃色葡萄球菌的潛在靶點(diǎn)，任何對(duì)ldh-1具有選擇性抑制作用的小分子物質(zhì)，即只抑制金黃色葡萄球菌ldh-1但對(duì)人類的乳酸脫氫酶同功酶無明顯抑制作用，就可能成為一種新的抗生素。 研究方法：本研究首先將金黃色葡萄球菌中編碼ldh-1和ldh-2的基因全長(zhǎng)克隆到表達(dá)載體p

4、ET-28a中，大量表達(dá)重組蛋白，再利用重組蛋白的Histag，以親和層析法和分子篩兩步聯(lián)合方法純化重組蛋白純度超過95%。進(jìn)而，在不同理化條件下促使蛋白結(jié)晶，然后用所得到的單晶進(jìn)行X射線衍射以解析蛋白的三維機(jī)構(gòu)。 研究結(jié)果：l；dh-1蛋白結(jié)晶，并收集高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù)。初步分析屬于C2空間群，晶胞參數(shù)為a=131.36，b=74.362，c=103.243。ldh-1的結(jié)構(gòu)最終可以被精修到2.2 A，R-Factor為17%，R

5、free-factor為23.4%。使用分子置換法解析出其三維結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)2.2埃。每個(gè)晶胞中有兩個(gè)不對(duì)稱的乳酸脫氫酶分子。每個(gè)ldh-1分子中包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。大的結(jié)構(gòu)域由22-160和248-264號(hào)氨基酸形成具有典型Rossmann特征的折疊。通過蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列的多重序列比對(duì)，活性位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸序列保守，但活性環(huán)區(qū)上翹，使活性位點(diǎn)更加暴露。本研究還對(duì)ldh-1、ldh-2、人類骨骼肌ldh-A和心肌ldh-B的酶催化活性