一氧化氮調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的作用機(jī)制探討.pdf

1、一氧化氮(nitric oxide,NO)是生物體內(nèi)重要的活性分子,參與了生物體內(nèi)許多重要的生理過程,例如,動(dòng)物體內(nèi)的血管松弛、免疫防御、神經(jīng)傳遞以及植物體內(nèi)的種子萌發(fā)、鐵代謝、抗逆調(diào)節(jié)以及抗衰老調(diào)節(jié)等,被認(rèn)為是多功能的第二信使。NO在動(dòng)物以及高等植物體內(nèi)的研究已受到廣泛的重視并取得重要進(jìn)展,然而其在細(xì)菌中,尤其是細(xì)菌形成的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)一細(xì)菌生物被膜(biofilm)中的作用卻極少有人研究。細(xì)菌生物被膜是由細(xì)菌和其分泌的胞外基質(zhì)在物體表面

2、形成的高度組織化的多細(xì)胞結(jié)構(gòu),是細(xì)菌產(chǎn)生抗生素耐藥和逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊的主要原因,但其形成的分子機(jī)制比較復(fù)雜,涉及到許多的信號通路和調(diào)節(jié)蛋白,闡明細(xì)菌生物被膜形成機(jī)理對于細(xì)菌生物被膜相關(guān)感染的治療具有重要意義。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),NO能促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物被膜形成,本論文主要是在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上,對NO調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 金黃色葡萄球菌致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和大量的胞外多糖(PIA/

3、PNAG)是影響其體內(nèi)遺傳操作的主要原因,首先利用實(shí)驗(yàn)室分離得到的糖粘附素降解酶多聚β-1,6-N-乙酰葡聚糖胺裂解酶(DSPB)對金黃色葡萄球菌的電擊轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。PIA是β-1-6-N-乙酰胺基葡萄糖多聚物,DSPB能專一降解PIA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在從限制缺陷菌株RN4220中提取質(zhì)粒過程中,加入DSPB對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可以明顯提高質(zhì)粒的純度和數(shù)量。利用0.1U的DSPB制備感受態(tài)細(xì)胞,其轉(zhuǎn)化效率相比于未處理組提高了100

4、0倍,而且其效果優(yōu)于溶菌酶和溶葡萄球菌酶。
　　 為了進(jìn)一步確證內(nèi)源NOS對金黃色葡萄球菌生物被膜的調(diào)節(jié)作用,利用表達(dá)載體對Saureus RN6390△nos中nos基因進(jìn)行回補(bǔ),結(jié)果表明nos基因回補(bǔ)后回復(fù)了其生物被膜形成能力,說明內(nèi)源性NOS在金黃色葡萄球菌生物被膜形成中具有重要作用。同時(shí),采用96孔板和Flow-cell兩種不同的生物被膜模型,通過外源加入NO供體SNP進(jìn)一步驗(yàn)證了外源性NO同樣能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌RN

5、6390的生物被膜形成。
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道葡萄球菌生物被膜的形成方式分PIA依賴型和PIA非依賴型,PIA合成增加能促進(jìn)生物被膜的形成。那么外源NO是否是通過調(diào)節(jié)PIA的合成促進(jìn)生物被膜的形成呢?實(shí)時(shí)熒光定量PCR和胞外多糖檢測結(jié)果表明加入NO供體SNP后ica的表達(dá)量和PIA的產(chǎn)生量均降低,證明NO對S.aureus生物被膜形成的調(diào)節(jié)作用不是通過促進(jìn)PIA的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的。
　　 S.aureusRN6390的雙組分調(diào)

6、節(jié)系統(tǒng)srrAB與枯草桿菌ResDE雙組分系統(tǒng)高度同源,而ResDE能通過NsrR蛋白感受NO或者其衍生信號從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。那么srrAB是否也能感受NO呢?定量PCR檢測顯示,生物被膜中srrAB表達(dá)量顯著提高,表明srrAB與生物被膜形成密切相關(guān)。通過同源重組構(gòu)建了S.aureusRN6390的雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)srrAB的缺失突變株,檢測NO對其生物被膜形成的促進(jìn)作用是否依賴于srrAB。結(jié)果表明srrAB缺失后生物被膜形成能力降

7、低,但NO對其生物被膜形成的促進(jìn)效應(yīng)仍然存在,因此NO對金黃色葡萄生物被膜形成的促進(jìn)與srrAB無關(guān)。
　　 綜上,本論文在前期研究的基礎(chǔ)上初步探討了NO調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的作用機(jī)制,證實(shí)了這種調(diào)節(jié)作用并不依賴于能夠編碼多糖胞間粘附素的ica和雙組份系統(tǒng)srrAB。本論文揭示了NO在細(xì)菌生物被膜形成過程中的作用,并對作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討,為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù),同時(shí),為細(xì)菌生物被膜形成的調(diào)節(jié)機(jī)制和細(xì)菌生物被膜