SigB(Q225P)突變促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的作用與機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、生物被膜(biofilm,BF)是指附著在有生命體或非生命體表面的由細(xì)菌自身分泌的胞外多聚物包裹細(xì)菌所形成的膜樣物。胞外多聚物由多糖、蛋白質(zhì)及胞外DNA(eDNA)組成。簡單的說,細(xì)菌生物被膜主要包括被包裹的細(xì)菌和細(xì)菌自身分泌的胞外基質(zhì)。生物被膜的形成猶如給被包裹著的細(xì)菌添加了一層屏障,因此生物被膜的形成可以顯著增強(qiáng)細(xì)菌耐受不利環(huán)境的能力。有研究報道,成熟生物被膜包裹的細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性為浮游狀態(tài)的細(xì)菌的1/10-1/1000,耐熱

2、性也相應(yīng)增加,對環(huán)境變化不敏感[1]。因此生物被膜的形成是細(xì)菌抵御外界不利環(huán)境的一種重要形式,也是造成臨床感染難以治療的重要因素之一。形成生物被膜的細(xì)菌主要有銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。
  金黃色葡萄球菌,俗稱金葡菌,呈圓形或卵圓形,革蘭染色陽性,是一種重要的病原

3、菌。金葡菌能引起皮膚軟組織感染、肺炎、感染性心內(nèi)膜炎、骨髓炎以及食物中毒等。隨著抗生素的廣泛使用,金葡菌的耐藥性變得愈發(fā)嚴(yán)峻[2,3],例如耐甲氧西林的金葡菌MRSA,中介耐萬古霉素的金葡菌VISA,耐萬古霉素的金葡菌VRSA等的出現(xiàn)和流行,給臨床抗感染治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織(WHO)已將MRSA/VISA列為高度優(yōu)先迫切需要開發(fā)抗菌藥物的12種“超級細(xì)菌”之一。生物被膜的形成是金葡菌產(chǎn)生耐藥性的重要原因。盡管金葡菌生物被膜形

4、成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,但根據(jù)胞外基質(zhì)組分可將金葡菌生物被膜的調(diào)控途徑分為三條,分別是多糖合成途徑、蛋白質(zhì)合成途徑,以及eDNA合成途徑。
  本課題組前期從我校某附屬醫(yī)院一膿毒癥患者體內(nèi)分離獲得一株金葡菌,命名為XQ株。在體外連續(xù)培養(yǎng)時,獲得一株顏色變白的新菌株,命名為XQW株。由于XQW株在液體培養(yǎng)基中呈絮狀生長,推測其生物被膜形成能力可能有所增強(qiáng)。為了證實(shí)該假設(shè),我們采用結(jié)晶紫染色法和激光共聚焦顯微鏡檢測并比較了XQ株與XQW

5、株的生物被膜形成差異;通過全基因組測序,發(fā)現(xiàn)XQW株存在SigB(Q225P)突變;利用基因位點(diǎn)替換和回補(bǔ)菌株驗(yàn)證了SigB(Q225P)突變在金葡菌生物被膜形成中的作用。隨后,利用RT-qPCR檢測比較XQ株與XQW株生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)耐熱核酸酶基因nuc在XQW株中表達(dá)顯著下降,可能影響金葡菌生物被膜形成,進(jìn)一步通過lacZ報告系統(tǒng)和EMSA初步探討了SigB(Q225P)調(diào)控金葡菌生物被膜形成的機(jī)制。主要內(nèi)容和結(jié)果

6、如下:
  1.SigB(Q225P)突變促進(jìn)金葡菌生物被膜形成的作用研究
  (1) XQ株與XQW株的生物被膜形成能力比較。
  ①從體外傳代中獲得的菌落顏色變白的XQW株在液體培養(yǎng)基中呈絮狀生長,我們首先通過結(jié)晶紫染色法比較了XQ株與XQW株的生物被膜形成能力。結(jié)果表明,與XQ野生型相比,XQW株的生物被膜形成能力明顯增強(qiáng)。
  ②通過激光共聚焦顯微鏡觀察XQ株與XQW株所形成的生物被膜,結(jié)果顯示XQW株的

7、生物被膜較XQ株厚而致密,表明XQW株的生物被膜形成能力較XQ株強(qiáng)。
  (2) SigB(Q225P)突變可能是XQW株生物被膜形成增強(qiáng)的重要原因
  ①為探索XQW生物被膜形成增強(qiáng)的原因,我們對XQ株和XQW株進(jìn)行了全基因組測序(XQ株基因組GenBank登錄號:CP013137)?;蚪M比較發(fā)現(xiàn),與XQ相比,XQW株的基因組DNA發(fā)生了527處點(diǎn)突變,其中392處突變導(dǎo)致了相應(yīng)基因編碼的氨基酸發(fā)生改變,可能影響161個

8、基因的功能。根據(jù)XQW株顏色變白及生物被膜形成增強(qiáng)的表型,我們進(jìn)一步利用BLAST比較了與金葡菌色素合成相關(guān)及與生物被膜形成有關(guān)的基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)XQW的sigB發(fā)生了點(diǎn)突變,該基因的第674位堿基由A突變?yōu)镃,使得SigB蛋白第225位谷氨酰胺突變?yōu)楦彼?Q225P)。
 ?、趕ifB在金葡菌中的作用。已有文獻(xiàn)報道,sigB基因在金葡菌中除了調(diào)控色素的合成之外,還具有調(diào)控毒力因子表達(dá),促進(jìn)生物被膜形成以及調(diào)節(jié)耐藥性等多種生物學(xué)功

9、能。通常,一個基因的突變可使該基因的功能喪失。據(jù)文獻(xiàn)報道,sigB基因缺失株的生物被膜形成能力下降。然而,我們檢測到的SigB(Q225P)是一種新發(fā)現(xiàn)的sigB突變,該突變可能使XQW株生物被膜的形成能力增強(qiáng),這引起了我們深入探索SigB(Q225P)突變促進(jìn)金葡菌生物被膜形成機(jī)制的興趣。這一新的突變類型反而導(dǎo)致生物被膜形成能力增強(qiáng)。接下來我們希望探究SigB(Q225P)突變?nèi)绾未龠M(jìn)金葡菌生物被膜形成的機(jī)制。同時也可進(jìn)一步檢測Sig

10、B(Q225P)在不同的金葡菌中是否均能促進(jìn)生物被膜的形成。
  (3) SigB(Q225P)促進(jìn)金葡菌生物被膜的形成
  因XQ株為臨床金葡菌分離株,遺傳操作難以進(jìn)行。為深入探究SigB(Q225P)突變在促進(jìn)金葡菌生物被膜形成中的作用,我們利用金葡菌Newman進(jìn)行遺傳操作,構(gòu)建相關(guān)突變菌株和回補(bǔ)菌株,檢測它們的生物被膜形成差異,驗(yàn)證SigB(Q225P)突變在促進(jìn)金葡菌生物被膜形成中的作用。
  ①基因替換突變

11、株Newman-sigB(Q225P)的構(gòu)建。分別以XQW株、Newman株
  基因組為模板,擴(kuò)增sigB上游及sigB(Q225P)序列,依次克隆到大腸埃希菌-金葡菌穿梭質(zhì)粒pBT2中,構(gòu)建pBT2-sigB(Q225P)。通過電轉(zhuǎn)化將pBT2-sigB(Q225P)轉(zhuǎn)入金葡菌RN4220中,并通過PCR和酶切進(jìn)行驗(yàn)證。接著將經(jīng)過RN4220修飾后的pBT2-sigB(Q225P)電轉(zhuǎn)入金葡菌Newman中,根據(jù)pBT2對溫度

12、敏感的特性,我們篩選出疑似的Newman-sigB(Q225P),最后通過測序進(jìn)行鑒定。測序結(jié)果顯示基因替換突變株Newman-sigB(Q225P)構(gòu)建成功。
 ?、诨蚯贸闚ewman-△sigB的構(gòu)建。以金葡菌Newman基因組為模板擴(kuò)增sigB基因的上下游片段,依次將上下游片段克隆到pBT2中,獲得pBT2-△sigB。再將pBT2-△sigB轉(zhuǎn)化Newman,篩選獲得Newman-△sigB。
 ?、刍匮a(bǔ)菌株Ne

13、wman-△sigB/sigB的構(gòu)建。以金葡菌Newman基因組為模板分別擴(kuò)增sigB-promoter、sigB序列,依次將片段克隆到大腸埃希菌-金葡菌穿梭質(zhì)粒pLI50中,構(gòu)建pLI50-sigB重組表達(dá)質(zhì)粒。通過電轉(zhuǎn)化將pLI50-sigB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入金葡菌Newman-△sigB中,通過Western blot驗(yàn)證pLI50-sigB在Newman-△sigB中表達(dá)相應(yīng)的SigB。
 ?、芑匮a(bǔ)菌株Newman-△sigB/

14、sigB(Q225P)的構(gòu)建。分別以Newman、XQW基因組為模板擴(kuò)增sigB-promoter、sigB(Q225P),依次將片段克隆到大腸埃希菌-金葡菌穿梭質(zhì)粒pLI50中,構(gòu)建pLI50-sigB(Q225P)。轉(zhuǎn)化并獲得回補(bǔ)菌株Newman-△sigB/sigB(Q225P)。
 ?、萆锉荒ば纬赡芰z測。對Newman、Newman-sigB(Q225P)、Newman-△sigB/sigB、Newman-△sigB/

15、sigB(Q225P)等菌株的生物被膜形成能力進(jìn)行檢測和比較。結(jié)晶紫染色法結(jié)果表明Newman-sigB(Q225P)基因替換突變株的生物被膜形成能力明顯強(qiáng)于Newman野生型,該結(jié)果與在XQW株中的發(fā)現(xiàn)相一致。并且Newman-△sigB/sigB(Q225P)的生物被膜形成能力強(qiáng)于Newman-△sigB/sigB。激光共聚焦顯微鏡檢測也證實(shí)N ewman-sigB(Q225P)的生物被膜形成能力較Newman野生型厚而致密。這些結(jié)

16、果表明,sigB(Q225P)突變具有促進(jìn)金葡菌生物被膜形成的作用。
  2.SigB(Q225P)促進(jìn)金葡菌生物被膜形成的機(jī)制探討
  (1)RT-qPCR檢測并篩選XQW株生物被膜形成增強(qiáng)的相關(guān)基因。根據(jù)金葡菌胞外基質(zhì)組分可將金葡菌的生物被膜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分為三條途徑,即胞外多糖合成途徑、蛋白質(zhì)合成途徑,和eDNA合成途徑。我們根據(jù)這三條途徑篩選了nuc、fnbA、fnbB、clfA、icaA基因作為檢測靶標(biāo)。結(jié)果表明,與XQ

17、株相比,XQW株的耐熱核酸酶編碼基因nuc的表達(dá)水平顯著下降。作為降解生物被膜中主要成分eDNA的功能酶,nuc表達(dá)降低將促進(jìn)eDNA的積累,有利于生物被膜形成。
  (2)SigB(Q225P)間接調(diào)控nuc基因的表達(dá)水平。為探索Sig(Q225P)下調(diào)nuc表達(dá)的分子機(jī)制,我們構(gòu)建了nuc基因啟動子控制的LacZ報告質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)化Newman和Newman-sigB(Q225P),LacZ活性檢測結(jié)果顯示nuc啟動子在Newm

18、an-sigB(Q225P)中的活性較Newman野生株明顯下降,表明SigB(Q225P)突變確實(shí)能影響nuc的表達(dá)。然而,進(jìn)一步利用重組表達(dá)的SigB和SigB(Q225P)蛋白進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn),結(jié)果并未顯示SigB或SigB(Q225P)蛋白能與nuc啟動子區(qū)直接結(jié)合。因此,我們推測SigB(Q225P)對nuc基因的表達(dá)調(diào)控是間接的。
  3.結(jié)論:SigB(Q225P)突變通過間接下調(diào)nuc表達(dá)水平從而促進(jìn)金黃色葡萄球菌

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