大黃素與乳酸菌生物表面活性劑干預(yù)金黃色葡萄球菌生物被膜形成研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種重要的常見病原菌，可以導(dǎo)致人或動物皮膚軟組織的化膿，肺炎、胸膜炎、心內(nèi)膜炎，甚至全身敗血癥等多種感染病癥。在侵染部位形成生物被膜(bacterial biofilms，BF)是金黃色葡萄球菌的一個重要特征，病原菌形成生物膜不僅增強了病原菌本身的致病力，并且對抵抗宿主免疫系統(tǒng)和抗生素的能力大大提高，因此尋找新型有效的抗病原菌生物被膜藥物已成為目前研究的前沿和熱點。
　

2、　由于亞抑菌濃度下的抗生素易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的問題，在新型抗菌、抗生物被膜藥物和藥物靶標(biāo)開發(fā)中，自然界的天然產(chǎn)物和中草藥中有抗菌活性的單體小分子化合物，均成為新藥研發(fā)的寶貴資源。另外，益生乳酸菌生物表面活性劑(BS)憑借優(yōu)良的安全性和抗菌、抗粘附等生物活性，在研發(fā)生物醫(yī)藥、新型抗菌、抗生物被膜制劑方面有極大的應(yīng)用前景。
　　本研究首先以金黃色葡萄球菌為細(xì)菌生物被膜體外模型，首先考察了大黃素、木犀草素、黃芩苷、鹽酸小檗堿4種中藥單

3、體抗金葡浮游菌活性，篩選出抗浮游菌活性良好的大黃素作為重點研究對象，考察亞MIC濃度下的大黃素對金黃色葡萄球菌體外生物被膜形成的干預(yù)作用并對其干預(yù)機制進(jìn)行初步分析。結(jié)果顯示，大黃素對金葡浮游菌生長(MIC:4～8μg/mL)和溶血素的釋放均有良好的抑制作用，亞MIC濃度的大黃素(1/2MIC、1/4MIC)對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成有抑制作用。掃描電鏡(SEM)觀察大黃素干預(yù)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的形態(tài)學(xué)變化與結(jié)晶紫半定量黏附試

4、驗的結(jié)果相符合。針對大黃素對金黃色葡萄球菌生物被膜形成可能的干預(yù)機制，我們發(fā)現(xiàn)大黃素可以抑制金黃色葡萄球菌胞外DNA(eDNA)的釋放，且呈劑量依賴性。利用real-time PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)亞MIC大黃素(1/2MIC、1/4MIC)濃度下，生物被膜形成的相關(guān)基因cidA、icaA、dltB、agrA、sarA、sortaseA mRNA表達(dá)水平顯著下降。另外，亞MIC濃度的大黃素對金黃色葡萄球菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)信號分子AI-2

5、的釋放也有一定影響。
　　同樣以金黃色葡萄球菌為細(xì)菌生物被膜體外模型，提取4株益生活性、抑菌活性良好的益生乳酸菌BS，對4株乳酸菌BS提取物的抗菌、抗粘附、抗生物被膜活性進(jìn)行考察并對其抗生物被膜形成機制進(jìn)行初步分析。結(jié)果顯示，4組乳酸菌BS提取物對金黃色葡萄球菌浮游菌MIC值均大于100mg/mL，干預(yù)劑對浮游菌生長曲線的測定結(jié)果表明4組乳酸菌BS在12.5～50mg/mL濃度下對金黃色葡萄球菌浮游菌的生長沒有影響。50mg/mL

6、的4組乳酸菌BS對金黃色葡萄球菌溶血素釋放的抑制作用明顯。抗粘附實驗結(jié)果表明4組乳酸菌BS在12.5～50mg/mL濃度下均可抑制細(xì)菌黏附。其中，兩株瑞士乳桿菌所產(chǎn)BS抗黏附活性更好。結(jié)晶紫半定量黏附試驗的結(jié)果顯示，4組乳酸菌BS均有抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成的能力，其中，50mg/mL濃度下的4組乳酸菌BS干預(yù)金葡菌生物被膜形成的能力均顯著(P＜0.01)。掃描電鏡對結(jié)晶紫半定量黏附實驗的結(jié)果進(jìn)行了驗證。針對4株乳酸菌BS對金黃色

7、葡萄球菌生物被膜形成可能的干預(yù)機制，利用RT-qPCR技術(shù)檢測了4株乳酸菌BS在12.5～50mg/mL濃度下對金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，各組乳酸菌BS對生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)的影響各有不同，瑞士乳桿菌27058 BS主要下調(diào)表達(dá)了agrA、sarA基因，瑞士乳桿菌27170 BS下調(diào)表達(dá)了agrA、cidA基因，乳酸片球菌27167 BS明顯抑制了icaA基因的表達(dá);而植物乳桿菌27172

8、BS對cidA基因的表達(dá)抑制最為明顯。以上結(jié)果表明，4株乳酸菌BS可能通過調(diào)控cid操縱子、ica操縱子和agr調(diào)節(jié)系統(tǒng)來影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。此外，4組乳酸菌BS對金黃色葡萄球菌AI-2信號分子的釋放均有影響，乳酸片球菌27167和瑞士乳桿菌27170 BS在12.5～50mg/mL濃度下對AI-2信號分子釋放的抑制作用顯著(P＜0.05)。我們對4組乳酸菌BS進(jìn)行SDS-

9、PAGE蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)其中含有蛋白成分，并選擇乳酸片球菌27167 BS15KDa附近處的蛋白條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，通過數(shù)據(jù)庫比對和相關(guān)軟件分析，該條帶共檢索到2種可能的蛋白。分別是:DNA starvation/stationary phase protectionprotein; ferritin-like dna-binding protein。
　　鑒于大黃素、乳酸菌BS良好的抗生物被膜活性，本研究嘗試將中藥單體與乳酸菌

10、BS聯(lián)合使用抗細(xì)菌生物被膜。以大黃素、乳酸菌BS單獨作用及兩者聯(lián)合作用對金黃色葡萄球菌生物被膜抑制率做顯著性分析比較可知，在低大黃素濃度(1/4MIC、1/8MIC)和低乳酸菌BS（12.5mg/mL）濃度下，4組乳酸菌BS與大黃素干預(yù)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成的聯(lián)合作用顯著。相反的，高濃度下的大黃素(MIC、1/2MIC)和乳酸菌BS(50mg/mL)干預(yù)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成無明顯的聯(lián)合作用。
　　本研究證實了大黃素、