金黃色葡萄球菌saeRS和agr對(duì)其分泌蛋白及毒力的影響.pdf

1、目的：金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，可以引起許多臨床表現(xiàn)不同的感染性疾病。它所致感染的多樣性和嚴(yán)重度取決于不同毒力因子的協(xié)同表達(dá)，而這些數(shù)量眾多的毒力因子的表達(dá)會(huì)受到不同調(diào)節(jié)系統(tǒng)的控制，同時(shí)這些調(diào)節(jié)系統(tǒng)之間也存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生多種毒力因子，其中殺白細(xì)胞素(Panton-Valentine Leukocidin，PVL)是社區(qū)獲得性金黃色葡萄球菌(community-acquired MRSA，CA-

2、MRSA)的重要毒力因子，PVL的致病作用近些年受到廣泛關(guān)注。金黃色葡萄球中的葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子(accessory generegulator, agr)和SaeRS(Staphylococcus aureus exoprotein expression)雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)金黃色葡萄球菌毒力因子的協(xié)同表達(dá)上起著重要作用。為了深入研究agr系統(tǒng)和SaeRS雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)金黃色葡萄球菌分泌蛋白及毒力的影響，我們?cè)谇捌诔晒?/p>

3、構(gòu)建的一株臨床分離金黃色葡萄球菌的agr缺失突變株的基礎(chǔ)上，又利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建了saeRS敲除突變株及saeRS、agr雙敲除突變株，并對(duì)其相關(guān)功能做了初步研究。
　　 方法：用PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌SA75的saeRS基因上下游同源臂，構(gòu)建同源重組質(zhì)粒pKOR1-△saeRS，將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220中進(jìn)行修飾，再電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌和agr基因敲除突變株中。將含有重組質(zhì)粒的金黃色葡萄球菌和agr基因敲除

4、突變株經(jīng)一系列變溫傳代培養(yǎng)，使用脫水四環(huán)素篩選saeRS缺失可疑突變株，對(duì)篩選到的可疑突變株用PCR和基因測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。確認(rèn)構(gòu)建成功后，使用Triton X-100檢測(cè)野生株和突變株間的自溶能力，應(yīng)用SDS-PAGE檢測(cè)基因敲除前后金黃色葡萄球菌(SA75)分泌蛋白的變化，使用血平板法檢測(cè)野生株和基因敲除株間溶血能力的改變，使用RT-PCR檢測(cè)saeRS及agr基因?qū)瘘S色萄球菌(SA75)hla、hlb、luks-PV和spa基因表達(dá)

5、的影響。
　　 結(jié)果：金黃色葡萄球菌于2010年2月分離自溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院一皮膚軟組織化膿性感染患者的膿液標(biāo)本，經(jīng)革蘭染色、血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)及全自動(dòng)微生物分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌。經(jīng)PCR證實(shí)agr、saeRS基因陽性，lukS-PV基因陽性;將saeRS基因上游片斷的PCR產(chǎn)物(1000bp)、saeRS基因下游片斷的PCR產(chǎn)物(1000bp)兩者連接后插入質(zhì)粒pKOR1，成功構(gòu)建pKOR1-△saeRS。同源重組質(zhì)粒p

6、KOR1-△saeRS先被電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌RN4220進(jìn)行修飾，然后再電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌SA75和SA75△agr基因敲除突變株中。提高已轉(zhuǎn)入pKOR1-△saeRS的金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)溫度(42℃)，之后降溫進(jìn)行培養(yǎng)(30℃)，促進(jìn)同源重組的發(fā)生，利用脫水四環(huán)素的誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行篩選，獲得疑似突變株。在saeRS基因上游片段的上游和下游片段的下游各設(shè)計(jì)一條引物，以突變株的染色體基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片段比野生株SA75

7、基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的片段要少1724 bp。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，確認(rèn)敲除突變株構(gòu)建成功。在構(gòu)建完各突變株后，我們分析了SA75株和突變株SA75△saeRS、SA75△agr和SA75△saeRS△agr在生長(zhǎng)曲線、自溶能力、生化特性、分泌蛋白、溶血能力和蛋白水解能力等方面的差異。發(fā)現(xiàn)和SA75相比，各基因敲除突變株的生長(zhǎng)，自溶能力和生化特性并無別大的差異，僅SA75△agr和SA75△saeRS△agr在平臺(tái)后期生長(zhǎng)

8、有所增快，在生化特性上SA75△agr和SA75△saeRS△agr基因敲除株有較大的改變。在分泌蛋白上，我們發(fā)現(xiàn)和野生株相比，各突變株分泌蛋白的量和種類都有明顯的減少，尤其是SA75△saeRS△agr株，說明saeRS和agr是調(diào)控金黃色葡萄球菌外分泌蛋白的重要因子，但是就其具體調(diào)控哪些分泌蛋白還需要進(jìn)一步的研究。在溶血能力的檢測(cè)上，我們發(fā)現(xiàn)與野生株SA75相比，各基因敲除突變株溶血圈的直徑明顯減小，溶血圈也沒有野生株那么透明，而S

9、A75△saeRS△agr未見有溶血圈的產(chǎn)生。說明saeRS和agr也是調(diào)控金黃色葡萄球菌溶血毒素表達(dá)的重要調(diào)控因子。在水解蛋白能力上，我們發(fā)現(xiàn)SA75△saeRS和野生株SA75沒有發(fā)現(xiàn)蛋白水解圈的產(chǎn)生，而SA75△agr和SA75△saeRS△agr在孵育了6h后發(fā)現(xiàn)有明顯的蛋白水解圈的產(chǎn)生，且其水解圈直徑相當(dāng)。說明在金黃色葡萄球菌中agr基因缺失后，其蛋白水解能力增強(qiáng)。通過RT-PCR技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在敲除突變株中一些毒力因子基因，