CGI99在鹿茸軟骨組織生成中的作用.pdf

1、軟骨是細(xì)胞組成很單一的一種組織，具有很強(qiáng)的抗壓、抗撞擊能力。由于沒有血管分布，軟骨組織幾乎喪失了自我修復(fù)能力。而鹿茸軟骨是一種非常獨(dú)特的軟骨組織，它不僅在自然條件下能夠自我修復(fù)、再生，而且每年以一種驚人的速度再生。鹿茸季節(jié)性再生的特性使其成為研究器官及肢體再生基本過程的一個極具潛力的天然醫(yī)學(xué)模型。前期研究發(fā)現(xiàn) CGI99基因在鹿茸軟骨柱中高度表達(dá)（未發(fā)表），而在鹿茸的其他部位如血管中則幾乎不表達(dá)。因此推測其在鹿茸軟骨生成中具有一定的調(diào)節(jié)

2、作用，可能是軟骨發(fā)生過程中重要的調(diào)控分子，但目前CGI99基因在鹿茸軟骨生成過程中的具體作用機(jī)理還不清楚。研究表明，鹿茸的發(fā)生起始于生茸區(qū)骨膜(Antlerogenic Periosteum，AP)，是依賴干細(xì)胞的過程，故本實(shí)驗(yàn)以鹿茸生茸區(qū)骨膜細(xì)胞中的CGI99基因?yàn)檠芯繉ο?，在離體條件下初步探討該基因在鹿茸軟骨發(fā)生中的作用。
　　首先，針對 CGI99基因序列，設(shè)計(jì)并篩選高分 RNAi靶序列，同時設(shè)計(jì)一對陰性對照序列，將對應(yīng)的

3、shRNA序列化學(xué)合成后退火并連接，構(gòu)建重組載體質(zhì)粒 pLVTHM；通過 PCR對重組質(zhì)粒進(jìn)行陽性克隆篩選并通過測序進(jìn)一步鑒定，使用三質(zhì)粒系統(tǒng)(pLVTHM、pSPAX2、pMD2.G)共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞得到慢病毒粒子；用慢病毒顆粒感染 AP細(xì)胞，培養(yǎng)出可穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，通過RT-PCR及Western-Blot從基因及蛋白水平檢測沉默效率；通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測CGI99基因沉默對AP細(xì)胞增殖影響；對穩(wěn)定的AP細(xì)胞系進(jìn)行微粒體培養(yǎng)，將成

4、活的微粒體制作石蠟切片，染色后觀察切片中細(xì)胞團(tuán)的生長分化趨勢；提取微粒體總 RNA并反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，通過 RT-PCR檢測軟骨標(biāo)志性基因CollagenⅡmRNA的表達(dá)情況，以鑒定微粒體中的軟骨分化趨勢。
　　結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)通過篩選成功獲得了1條梅花鹿CGI99基因的高分RNAi靶序列，PCR及測序鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建可重組質(zhì)粒 pLVTHM；通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，成功獲得了重組慢病毒粒子；被重組慢病毒感染的AP細(xì)胞表達(dá)綠

5、色熒光蛋白，RT-PCR結(jié)果顯示，干擾效率達(dá)到70.8％，成功干擾了CGI99 mRNA在AP細(xì)胞中的表達(dá)；Western-Blot結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組AP細(xì)胞中CGI99蛋白明顯減少；MTT實(shí)驗(yàn)中三種細(xì)胞得出的數(shù)據(jù)，繪制曲線后基本趨于一致，說明CGI99基因的沉默不會影響AP細(xì)胞的增殖；通過微粒體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)成功獲得了肉眼可見的致密球形微粒體；微粒體切片后染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組微粒體軟骨發(fā)生趨勢微弱，與陰性對照組及未感染的空白對照組對比差異顯著