MicroRNA-99a在腎細胞癌中的表達及作用機制.pdf

1、腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）在泌尿系統(tǒng)中是最為常見的惡性腫瘤之一，它的生物學活動極其復(fù)雜多變，發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機制至今仍不明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA-99a（miR-99a）在舌鱗狀細胞癌、漿膜卵巢癌、肝癌、鱗狀細胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌及兒童腎上腺皮質(zhì)腫瘤等多種腫瘤中的表達水平均下調(diào)，并且對這些腫瘤的生長有明顯的抑制作用，預(yù)示著miR-99a可能作為潛在的腫瘤抑制因子用于腫瘤的診斷與治療。基于

2、目前尚未有miR-99a在腎癌中的研究報道，本研究在腎癌組織標本及腎癌細胞中檢測miR-99a的表達水平，分析miR-99a表達與預(yù)后的相關(guān)性，通過體外及體內(nèi)實驗研究miR-99a對腎癌細胞功能及腫瘤進展的影響，檢測相關(guān)信號通路，進一步探討可能的作用機制，以期給腎癌的診斷和治療帶來新的思路。
　　第一部分 miR-99a在腎癌中的表達及臨床意義
　　目的：探討腎癌細胞系、腎癌組織及相應(yīng)癌旁組織中miR-99a的表達，并分析與

3、臨床特征的關(guān)系，探討腎細胞癌患者的臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT–PCR）檢測腎小管上皮細胞株HK-2、腎癌細胞株786-0、腎癌細胞株OS-RC-2以及40例腎癌組織和相應(yīng)癌旁組織的miR-99a的表達水平，并對其進行比較和相關(guān)分析。
　　結(jié)果：qRT-PCR結(jié)果顯

4、示786-0及OS-RC-2中miR-99a表達明顯低于HK-2，相對于癌旁組織，腎癌標本中miR-99a表達明顯下調(diào)。Kaplan-Meier分析顯示，miR-99a表達水平降低的患者生存期顯著縮短。
　　結(jié)論：miR-99a在腎癌組織和細胞中明顯低表達，miR-99a表達水平下降的患者生存期明顯縮短，提示miR-99a可能成為腎癌診斷及預(yù)后的新標志物。
　　第二部分 miR-99a對腎癌細胞功能及腫瘤進展的影響
　

5、　目的：通過細胞功能實驗及裸鼠成瘤模型研究miR-99a對腎癌細胞功能及腫瘤進展的影響。
　　方法：應(yīng)用合成的miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0及OS-RC-2，采用細胞增值檢測、克隆形成檢測、遷移檢測、侵襲檢測、流式細胞檢測，觀察上調(diào)miR-99a表達對腎癌細胞功能及細胞周期的影響。裸鼠皮下注射786-0成瘤后再次注射miR-99a模擬物，觀察上調(diào)miR-99a表達對裸鼠成瘤的影響。
　　結(jié)果：細胞功能實驗表明轉(zhuǎn)染miR-

6、99a模擬物可對腎癌細胞的增殖、存活、遷移、侵襲起到抑制作用，并誘導(dǎo)細胞周期G1期的阻滯，動物實驗顯示注射miR-99a模擬物后腫瘤生長明顯受抑制。
　　結(jié)論：miR-99a高表達可明顯抑制腎癌細胞功能及腫瘤進展，提示miR-99a可能成為治療腎癌的有效調(diào)節(jié)靶點。
　　第三部分 miR-99a調(diào)控腎癌進展相關(guān)信號通路的機制研究
　　目的：檢測哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamyc

7、in，mTOR）及其通路下游相關(guān)因子在腎細胞癌中受到miR-99a調(diào)控后的表達情況，進一步探討miR-99a通過mTOR信號通路抑制腫瘤進展的機制。
　　方法：通過生物信息搜索miR-99a的靶基因。在HK-2、786-0及OS-RC-2中檢測mTOR的表達情況。miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0及OS-RC-2，檢測mTOR的表達水平變化。裸鼠皮下注射786-0成瘤后再次注射miR-99a模擬物，檢測腫瘤組織中mTOR的表達水平

8、變化。miR-99a的靶基因通過熒光素酶活性實驗驗證。miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0，檢測mTOR信號通路相關(guān)因子及下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白的表達水平變化。mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染786-0，采用細胞增值檢測、克隆形成檢測、遷移檢測、侵襲檢測、流式細胞檢測，觀察下調(diào)mTOR對腎癌細胞功能及細胞周期的影響。
　　結(jié)果：生物信息搜索提示mTOR是miR-99a的靶基因，mTOR在腎癌細胞中的表達明顯高于HK-2，腎癌細胞及動物模型中上

9、調(diào)miR-99a后mTOR表達明顯下調(diào)，熒光素酶活性實驗證實mTOR是miR-99a的靶基因。miR-99a模擬物轉(zhuǎn)染786-0后mTOR信號通路相關(guān)因子及細胞周期相關(guān)蛋白均表達下調(diào)，mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染786-0可抑制腎癌細胞增殖、存活，并阻滯細胞周期G1期，而細胞遷移及侵襲不受抑制。
　　結(jié)論： mTOR是miR-99a的靶基因，miR-99a可直接通過mTOR信號通路來誘導(dǎo)細胞周期G1期的阻滯，下調(diào)mTOR可部分擬表型腎