脂代謝相關(guān)基因CGI-58在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展受到基因的不穩(wěn)定性及腫瘤微環(huán)境的雙重調(diào)控。許多證據(jù)已經(jīng)表明腫瘤微環(huán)境在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,但其作用機(jī)制仍不清楚。纖連蛋白是腫瘤微環(huán)境中重要的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,存在不同的可變剪接變異體,其中EDA+FN特異性的高表達(dá)于多種惡性腫瘤,且與多種腫瘤的惡性表型相關(guān),但EDA對(duì)腫瘤生物學(xué)特性的影響及其具體分子機(jī)制尚不清楚。
　　代謝是機(jī)體生命活動(dòng)的基本特征,正常細(xì)胞向惡性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)生多種

2、生物學(xué)特性的改變,其中代謝重編程是其最顯著的特征之一。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),某些癌基因的激活或抑癌基因的失活可調(diào)控代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)揮其促癌或抑癌作用,且某些代謝酶本身即可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤有氧糖酵解是最早被發(fā)現(xiàn)和研究的腫瘤代謝重編程,即腫瘤細(xì)胞即使在有氧環(huán)境下,也主要以糖酵解而非產(chǎn)能效率更高的線粒體氧化磷酸化的方式供能(Warburg效應(yīng))。葡萄糖和脂肪酸代謝是能量的主要來(lái)源,既往關(guān)于腫瘤代謝的研究主要集中在糖代謝,近年來(lái)

3、的研究發(fā)現(xiàn),脂代謝異常也參與調(diào)控了多種腫瘤的惡性表型,但脂代謝在惡性腫瘤中的具體作用及機(jī)制仍知之甚少。結(jié)腸癌已被證實(shí)為糖酵解異常增強(qiáng)的腫瘤,而腫瘤組織中脂質(zhì)的異常沉積也是其重要表型,但結(jié)腸癌中這種糖脂代謝紊亂的原因及機(jī)制尚不明確。研究證實(shí),腫瘤微環(huán)境參與調(diào)控了腫瘤代謝的重編程,而腫瘤微環(huán)境成分EDA是否參與了對(duì)結(jié)腸癌代謝的調(diào)控仍有待于進(jìn)一步探討。
　　本研究通過(guò)慢病毒載體建立EDA過(guò)表達(dá)及干擾表達(dá)的細(xì)胞模型,研究了EDA對(duì)結(jié)腸癌及

4、鼻咽癌生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中EDA的過(guò)表達(dá)可顯著抑制脂代謝相關(guān)基因CGI-58的表達(dá)活性,結(jié)腸癌中CGI-58呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)缺失。既往研究表明,CGI-58是脂質(zhì)分解的一個(gè)強(qiáng)有力的活化因子,其缺乏導(dǎo)致脂滴大量沉積,且CGI-58缺乏的小鼠對(duì)葡萄糖利用顯著增加。因此我們猜測(cè),結(jié)腸癌中CGI-58缺乏是導(dǎo)致腫瘤組織中脂質(zhì)異常沉積和糖酵解增強(qiáng)的重要原因。為進(jìn)一步明確CGI-58在結(jié)腸癌生物學(xué)特性中的作用,我們通

5、過(guò)建立腸道CGI-58特異性敲除的ApcMin/+小鼠,CGI-58敲低和CGI-58過(guò)表達(dá)細(xì)胞,聯(lián)合人結(jié)腸癌組織標(biāo)本,鑒定了CGI-58缺失在誘導(dǎo)代謝重編程促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　Wnt通路的激活與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),CGI-58缺失導(dǎo)致Wnt通路的靶基因c-MET表達(dá)顯著上調(diào),提示W(wǎng)nt通路被激活。我們的研究表明,CGI-58敲低細(xì)胞及CGI-58敲除小鼠腸道腫瘤中激活Wnt通路的經(jīng)典分子β-catenin的表達(dá)

6、及核轉(zhuǎn)位并無(wú)增加。因此,我們進(jìn)一步探討了CGI-58缺失經(jīng)非β-catenin依賴(lài)途徑誘導(dǎo)YAP/TAZ復(fù)合物核轉(zhuǎn)位,激活Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制。
　　為進(jìn)一步探討CGI-58在其他惡性腫瘤中是否同樣具有抑癌基因功能,我們根據(jù)腫瘤突變基因數(shù)據(jù)庫(kù)COSMIC的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),CGI-58在神經(jīng)來(lái)源腫瘤中也呈現(xiàn)顯著缺失。黑色素瘤是神經(jīng)來(lái)源的具有高度侵襲性的惡性腫瘤,已有研究報(bào)道脂代謝相關(guān)基因MAGL可顯著促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,為

7、進(jìn)一步明確CGI-58在其他惡性腫瘤中是否同樣具有抑癌基因作用,通過(guò)慢病毒載體建立的CGI-58敲低及過(guò)表達(dá)黑色素瘤細(xì)胞模型,結(jié)合黑色素瘤臨床腫瘤組織標(biāo)本,我們繼而研究了CGI-58在黑色素瘤分化及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制。
　　目的:
　　1、闡明結(jié)腸癌微環(huán)境成分EDA對(duì)結(jié)腸癌生物學(xué)特性的影響及作用機(jī)制;
　　2、驗(yàn)證EDA相關(guān)脂代謝基因CGI-58在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中作用及分子機(jī)制;
　　3、驗(yàn)證CGI-58在惡

8、性黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制;
　　4、揭示 CGI-58作為抑癌基因的功能,進(jìn)一步闡釋腫瘤微環(huán)境與腫瘤代謝之間相互調(diào)控促進(jìn)腫瘤惡性表型的作用及具體機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1、腫瘤組織芯片免疫組化染色用于臨床病理特征相關(guān)性分析;
　　2、慢病毒載體建立EDA及CGI-58敲低及過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型用于研究EDA和CGI-58功能;
　　3、 CGI-58腸道特異性敲除APCmin/+小鼠用于研究腸

9、道腫瘤發(fā)生發(fā)展。
　　結(jié)果:
　　1、EDA在結(jié)腸癌及鼻咽癌中發(fā)揮促癌作用。
　　EDA通過(guò)維持CD133+/CD44+結(jié)腸癌亞群細(xì)胞的特性促進(jìn)結(jié)腸癌惡性表型, Integrin/FAK/ERK信號(hào)途徑介導(dǎo)的Wnt/β-catenin通路激活是EDA促進(jìn)結(jié)腸癌“干性”特征的重要分子機(jī)制。結(jié)腸癌細(xì)胞分泌型EDA通過(guò)與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞整合素受體Integrinα9相互作用促進(jìn)出芽誘導(dǎo)因子Prox1的表達(dá)和細(xì)胞微絲蛋白的極性排

10、列,顯著促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、出芽和成管。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌型EDA通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移,FAK/Src/Snail信號(hào)途徑介導(dǎo)了血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌型EDA與結(jié)腸癌細(xì)胞表面integrinα9β1受體相互作用促進(jìn)細(xì)胞EMT和侵襲轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。此外,鼻咽癌組織中EDA促進(jìn)細(xì)胞放射抵抗,FAK/Akt/JNK信號(hào)途徑介導(dǎo)了EDA對(duì)鼻咽癌放療敏感性的影響。此外,我們的研究還表明,EDA可顯著調(diào)控脂代謝相關(guān)基因

11、CGI-58的表達(dá)。利用基因芯片對(duì)EDA過(guò)表達(dá)和對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較篩查發(fā)現(xiàn),EDA過(guò)表達(dá)細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1及多種糖酵解關(guān)鍵酶顯著上調(diào),而脂代謝相關(guān)基因比較基因組學(xué)鑒定蛋白58(CGI-58)表達(dá)明顯收到抑制。Western blots檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),EDA過(guò)表達(dá)細(xì)胞中CGI-58蛋白表達(dá)水平顯著下降。
　　2、CGI-58缺失啟動(dòng)代謝重編程誘導(dǎo)細(xì)胞惡變及發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展。
　　在結(jié)腸癌

12、組織中CGI-58的表達(dá)顯著低于癌旁組織和正常結(jié)腸組織,在結(jié)腸癌發(fā)生譜中,相比正常結(jié)腸粘膜組織,CGI-58的表達(dá)從炎癥到不典型增生無(wú)顯著變化,而在腺瘤中開(kāi)始出現(xiàn)部分缺失,且缺失率與腺瘤癌變密切相關(guān)。通過(guò)將CGI-58腸道特異性敲除小鼠模型與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展研究的經(jīng)典模型APCmin/+小鼠(腸道多發(fā)腺瘤小鼠模型)進(jìn)行雜交發(fā)現(xiàn),腸道特異性CGI-58敲除的APCmin/+小鼠腸道腫瘤數(shù)量及體積較對(duì)照小鼠顯著增加,且腸道腺瘤發(fā)生明顯的惡性轉(zhuǎn)

13、化。體外實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí),正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞CGI-58表達(dá)顯著高于結(jié)腸癌細(xì)胞,利用慢病毒載體敲低正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞中CGI-58表達(dá)后,細(xì)胞發(fā)生明顯的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),侵襲能力顯著增強(qiáng),且可在裸鼠體內(nèi)成瘤,而在結(jié)腸癌細(xì)胞中回復(fù)CGI-58的表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)其成瘤及侵襲能力。進(jìn)一步研究表明,CGI-58缺失的腸道上皮細(xì)胞中酯酶水解活性下降,胞內(nèi)出現(xiàn)大量中性脂質(zhì)沉積,脂肪酸線粒體氧化明顯受到抑制,同時(shí)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取明顯增加

14、,糖酵解關(guān)鍵酶表達(dá)上調(diào),且糖酵解中間產(chǎn)物明顯堆積。我們的研究還發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低的細(xì)胞內(nèi)AMPK/p53活性受到抑制,而PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被顯著激活,細(xì)胞自噬水平降低。結(jié)腸癌臨床標(biāo)本研究進(jìn)一步證實(shí),CGI-58在結(jié)腸癌中的缺失與結(jié)腸癌的分期分級(jí)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率呈顯著正相關(guān),與結(jié)腸癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。
　　3. GI-58缺失誘導(dǎo)YAP/TAZ核轉(zhuǎn)位激活Wnt信號(hào)通路。
　　Wnt通路的激活與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展

15、密切相關(guān),CGI-58缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞Wnt通路靶基因c-MET表達(dá)顯著上調(diào),提示W(wǎng)nt通路被顯著激活。CGI-58缺失細(xì)胞中β-catenin表達(dá)略有下降,且核轉(zhuǎn)位并無(wú)明顯增強(qiáng),提示CGI-58通過(guò)非β-catenin途徑激活了Wnt通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低細(xì)胞中TAZ表達(dá)增強(qiáng),YAP/TAZ復(fù)合物磷酸化顯著降低,核轉(zhuǎn)位明顯,且其共激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TEAD活性顯著上調(diào),提示YAP/TAZ促轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。同時(shí)CGI-58腸

16、道敲除小鼠模型研究結(jié)果也證實(shí),CGI-58敲除小鼠腸道腫瘤中TAZ表達(dá)增強(qiáng),且YAP/TAZ核轉(zhuǎn)位明顯強(qiáng)于對(duì)照組。免疫熒光及免疫共沉淀證實(shí)CGI-58與YAP/TAZ并無(wú)直接結(jié)合,而脂滴相關(guān)蛋白ADRP與YAP/TAZ之間有共定位及結(jié)合,提示CGI-58通過(guò)蛋白-蛋白相互作用促進(jìn)YAP/TAZ復(fù)合物去磷酸化而發(fā)生核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而通過(guò)增強(qiáng)共激活轉(zhuǎn)錄因子TEAD轉(zhuǎn)錄活性,上調(diào)Wnt靶基因c-MET表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移。

17、　　4. CGI-58缺失誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞去分化而促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　CGI-58在惡性黑色素瘤腫瘤組織中的表達(dá)與黑色素瘤生物學(xué)特性顯著相關(guān)。高侵襲黑色素瘤細(xì)胞中CGI-58表達(dá)顯著低于低侵襲黑色素瘤細(xì)胞。在低侵襲力黑色素瘤細(xì)胞中敲低CGI-58表達(dá)顯著促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移能力,同時(shí)細(xì)胞色素出現(xiàn)顯著丟失。代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)CGI-58敲低的黑色素瘤細(xì)胞中溶血磷脂酸(LPA)含量升高,且LPA受體表達(dá)顯著上調(diào),利用LPA受體阻斷劑可有效

18、逆轉(zhuǎn)CGI-58敲低引起的細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及去分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CGI-58敲低的黑色素瘤細(xì)胞中與細(xì)胞分化密切相關(guān)的Wnt5A表達(dá)顯著上調(diào),證實(shí)CGI-58引起的磷脂代謝重編程可誘導(dǎo)細(xì)胞去分化而促進(jìn)黑色素細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論:
　　1、結(jié)腸癌微環(huán)境中,結(jié)腸癌細(xì)胞分泌型EDA和內(nèi)皮細(xì)胞分泌型EDA均顯著促進(jìn)結(jié)腸癌的惡性表型。EDA/整合素信號(hào)途徑在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,是結(jié)腸癌靶向治療的特異性潛在靶標(biāo);EDA在

19、鼻咽癌中的高表達(dá)顯著促進(jìn)了鼻咽癌放療抵抗,因此阻斷EDA相關(guān)信號(hào)途徑是提高鼻咽癌放療敏感性的有效手段;EDA可能通過(guò)顯著調(diào)控代謝基因CGI-58的表達(dá)參與腫瘤代謝調(diào)控;
　　2、CGI-58缺失導(dǎo)致的細(xì)胞供能方式從線粒體氧化轉(zhuǎn)化為有氧糖酵解,可能是結(jié)腸癌糖酵解增強(qiáng)重要原因;結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中CGI-58特異性的表達(dá)活性缺失啟動(dòng)的結(jié)腸癌代謝重編程激活下游PI3K/Akt/mTOR促癌信號(hào)途徑,誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移,是

20、結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)理。
　　4、CGI-58缺失導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路顯著激活,但CGI-58缺失通過(guò)非經(jīng)典β-catenin途徑,而通過(guò)誘導(dǎo)YAP/TAZ復(fù)合物入核激活Wnt信號(hào),進(jìn)一步揭示了CGI-58缺失促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制;
　　5、CGI-58在黑色素瘤細(xì)胞中的缺失通過(guò)調(diào)控磷脂代謝誘導(dǎo)細(xì)胞去分化而促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移能力,揭示了脂代謝重編程促進(jìn)黑色素瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制,首次揭示了脂代謝重編程在黑色素瘤