STAT3在H-ras12V轉基因小鼠肝腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　探究STAT3在ras癌基因誘導的肝腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制。
　　方法:
　　1.提取9月齡H-ras12V轉基因雄鼠肝腫瘤組織(T)、腫瘤周圍組織(P)以及9月齡非轉基因雄鼠肝組織(Wt)樣本，經病理確認后，提取總蛋白質和總RNA;提取人正常肝細胞株L-O2和人肝癌細胞株Hep3B的總蛋白質和總RNA;應用蛋白質印跡法檢測組織和細胞樣本中p-ERK、ERK、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p

2、-mTOR、mTOR、p-STAT3、STAT3的蛋白水平;熒光定量PCR檢測STAT3下游靶基因pik3r1在組織和細胞樣本中的mRNA表達水平。
　　2.用抑制劑LY294002、PD184352和Rapamycin（RAPA）分別抑制Hep3B細胞的PI3K/AKT、ERK和mTOR信號通路活性，在抑制后3，6和12h提取總蛋白質，檢測抑制劑對STAT3蛋白及其磷酸化水平的影響，在抑制后6，12和18h提取總RNA，檢測抑制

3、劑對STAT3的下游靶基因pik3r1 mRNA水平的影響。
　　結果:
　　1.p-ERK的蛋白水平檢測表明:T組織中的p-ERK蛋白水平為22.09±6.57，與Wt組織的0.08±0.02相比顯著升高(t=5.80，P=0.004)，與P組織的8.60±3.23相比也顯著升高(t=3.19，P=0.033)，P組織比Wt組織顯著升高（t=4.57，P=0.045）;細胞水平檢測結果顯示，人肝癌細胞系Hep3B中的p-E

4、RK水平為人正常肝細胞系L-O2的10.87倍。ERK的蛋白水平檢測表明:T組織中的ERK蛋白水平為16.39±3.40，與Wt組織的5.27±1.43相比顯著升高（t=4.20，P=0.025），與P組織的4.76±1.79相比也顯著升高(t=5.24，P=0.006);細胞水平檢測結果顯示，人肝癌細胞系Hep3B中的ERK水平為人正常肝細胞系L-O2的24.77倍。p-PI3K的蛋白水平檢測結果表明:T組織中的p-PI3K蛋白水平為

5、0.45±0.04，與Wt組織的0.06±0.00相比顯著升高（t=8.12，P=0.004），與P組織的0.23±0.04相比也顯著升高(t=4.12，P=0.015)，P組織比Wt組織顯著升高（t=3.32，P=0.045）;細胞水平檢測結果顯示，p-PI3K水平在人正常肝細胞系L-O2和人肝癌細胞系Hep3B中沒有顯著差異。PI3K的蛋白水平檢測結果表明:T組織中的PI3K蛋白水平為0.87±0.13，與Wt組織的0.03±0.0

6、0相比顯著升高(t=10.56，P＜0.001)，與P組織的0.28±0.09相比也顯著升高（t=3.96，P=0.029），P組織比Wt組織顯著升高（t=3.43，P=0.019）;細胞水平檢測結果顯示，人正常肝細胞系L-O2中的PI3K水平為人肝癌細胞系Hep3B的500倍。p-AKT的蛋白水平檢測結果表明:T組織中的p-AKT蛋白水平為0.69±0.04，與Wt組織的0.10±0.02相比顯著升高(t=22.90，P＜0.001)

7、，與P組織的0.08±0.03相比也顯著升高(t=21.58，P＜0.001);細胞水平檢測結果顯示，人肝癌細胞系Hep3B中的p-AKT水平為人正常肝細胞系L-O2的6.77倍。AKT的蛋白水平檢測結果表明:T組織中的AKT蛋白水平為0.19±0.04，與Wt組織的0.08±0.05相比顯著升高（t=2.96，P=0.041），P組織中的AKT蛋白水平為0.25±0.04，與Wt組織的相比也顯著升高(t=4.38，P=0.012);細

8、胞水平檢測結果顯示，人肝癌細胞系Hep3B中的AKT水平為人正常肝細胞系L-O2的6.75倍。p-mTOR的蛋白水平檢測結果表明:T組織中的p-mTOR蛋白水平為0.44±0.02，與Wt組織的0.14±0.03相比顯著升高(t=14.36，P＜0.001)，與P組織的0.16±0.04相比也顯著升高（t=10.51，P＜0.001）;細胞水平檢測結果顯示，人肝癌細胞系Hep3B中的p-mTOR水平為人正常肝細胞系L-O2的21.74倍

9、。mTOR的蛋白水平檢測結果表明:mTOR的表達水平在Wt（0.18±0.06）、P（0.35±0.27）和T（0.61±0.67）之間沒有顯著差異;細胞水平檢測結果顯示，人正常肝細胞系L-O2中的mTOR水平為人肝癌細胞系Hep3B的5倍。p-STAT3的蛋白水平檢測結果表明:Wt組織中的p-STAT3蛋白水平為42.87±9.36，與T組織的4.27±0.72相比顯著升高（t=4.119，P=0.015），P組織中的p-STAT3蛋

10、白水平為32.47±3.21，與T組織的相比也顯著升高(t=8.73，P=0.001);細胞水平檢測結果顯示，人正常肝細胞系L-O2中的p-STAT3水平為人肝癌細胞系Hep3B的10倍。STAT3的蛋白水平檢測結果表明:Wt（25.81±8.97）、P（27.81±0.61）和T（26.67±0.43）中STAT3的水平沒有顯著差異;細胞水平檢測結果顯示，人正常肝細胞系L-O2中的STAT3水平為人肝癌細胞系Hep3B的2倍。熒光定量

11、PCR檢測結果顯示，與Wt相比，STAT3的靶基因pik3r1 mRNA水平在P、T中顯著降低(P＜0.01);細胞水平檢測結果顯示，同L-O2相比，pik3r1 mRNA水平在Hep3B中顯著降低(P＜0.001)。
　　2.抑制實驗結果顯示:應用LY294002抑制劑后，與對照組相比，隨著抑制時間的延長，p-AKT的水平逐漸降低，表明AKT的活化水平被有效抑制，與AKT的活化水平降低相反，p-STAT3水平明顯升高;應用PD1

12、84352抑制劑后，與對照組相比，p-ERK水平幾乎檢測不到，表明ERK的活化水平被有效抑制，與ERK的活化水平降低相一致，p-STAT3水平也明顯降低;應用RAPA抑制劑后，與對照組相比，在3h，p-mTOR水平明顯升高，與之相反，p-STAT3水平明顯降低，在6h，二者均沒有顯著變化，在12h，p-mTOR水平明顯降低，與之相反，p-STAT3水平明顯升高。應用LY294002和PD184352抑制劑后，同正常對照組相比，pik3r

13、1mRNA水平在6h，12h明顯升高，在18h又恢復到正常水平。應用RAPA抑制劑后，同正常對照組相比，pik3r1 mRNA水平在6h沒有明顯變化，在12和18h明顯升高。
　　結論:
　　體內檢測結果表明，在肝腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，ras信號通路的激活直接誘導了p-STAT3及其下游靶基因pik3r1 mRNA水平的降低，提示STAT3可能具有抑制肝腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。體外檢測結果也顯示STAT3可能具有抑制人肝癌細胞株