脂代謝相關(guān)基因ABHD5在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展及耐藥中的作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展機制不明是目前防治的主要瓶頸，并且由耐藥引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者治療失敗及影響預(yù)后的重要原因。因此，深入研究促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子及調(diào)控機制，尋找到逆轉(zhuǎn)耐藥和化療增敏的新靶點，對降低結(jié)腸癌的發(fā)病率，實現(xiàn)個體化精準(zhǔn)治療，提高患者生存質(zhì)量具有十分重要的意義。
　　自

2、噬(Autophagy)又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡(TypeⅡ programed cell death)，指細(xì)胞通過消化自身某些多余的細(xì)胞器，獲得存活所需的營養(yǎng)和能量物質(zhì)的生物學(xué)過程。自噬過程在進(jìn)化上趨于保守，是各類細(xì)胞在應(yīng)激狀況下氨基酸、核酸等生物大分子物質(zhì)的主要來源。細(xì)胞自噬反應(yīng)的機體內(nèi)環(huán)境“動態(tài)平衡”是維護(hù)細(xì)胞生存穩(wěn)態(tài)的重要保障，與細(xì)胞生長、個體發(fā)育及多種疾病發(fā)生密切相關(guān)。自噬功能缺陷可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，增加基因組不穩(wěn)定性，進(jìn)而

3、觸發(fā)細(xì)胞凋亡、老化、周期阻滯、導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及藥物抵抗等。在腫瘤的演變過程中，自噬更是具有雙刃劍效應(yīng)，一方面在腫瘤發(fā)生早期通過防止致癌物質(zhì)及損傷累積抑制腫瘤發(fā)生，另一方面，在腫瘤形成后通過為腫瘤細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境提供能源儲備促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。目前，已有較多證據(jù)表明，有效的調(diào)控細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)，是防治腫瘤發(fā)生發(fā)展及促進(jìn)化療增敏的關(guān)鍵，但目前對于腫瘤自噬的調(diào)控機制仍不十分清楚。
　　代謝重編程是惡性腫瘤的重要特征，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中伴隨多種代謝相關(guān)基

4、因的表達(dá)及活性異常。脂代謝相關(guān)基因含自水解酶域蛋白5(Abhydrolase domaincontaining5，ABHD5)是體內(nèi)甘油三酯水解過程中的重要輔酶，其本身雖不具有脂肪酶的活性，但它可通過激活甘油三酯脂肪酶調(diào)控脂肪組織和非脂肪組織中的脂肪分解代謝過程。既往有研究表明，該基因在結(jié)腸癌中發(fā)揮重要的抑癌作用，但其調(diào)控腫瘤發(fā)生的具體機制尚不清楚。已知自噬即參與細(xì)胞代謝平衡的調(diào)控也在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，但在腫瘤發(fā)生及藥物抵

5、抗過程中代謝相關(guān)基因的表達(dá)及活性異常是否參與了腫瘤細(xì)胞自噬水平的調(diào)控尚不明確。我們研究發(fā)現(xiàn)，ABHD5基因缺失可導(dǎo)致的細(xì)胞自噬水平降低，推測ABHD5介導(dǎo)的自噬改變是促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，并深入進(jìn)一步探索了ABHD5與Beclin1相互作用調(diào)控自噬的分子機制，證實了該基因在結(jié)腸癌發(fā)生及5-FU化療耐受中的作用。
　　目的:
　　1、明確ABHD5調(diào)控細(xì)胞自噬介導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的作用及分子機制。
　　2、研究AB

6、HD5在結(jié)腸癌患者預(yù)后和5-FU化療療效評價中的預(yù)測價值。
　　材料和方法:
　　1、利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立ABHD5敲除的CCD841CoN，F(xiàn)HC結(jié)腸上皮細(xì)胞系，基因敲除技術(shù)構(gòu)建腸道特異性ABHD5敲基因APCmin/+小鼠，結(jié)合數(shù)據(jù)庫分析，彗星實驗，染色質(zhì)穩(wěn)定性檢測，ABHD5代謝活性位點突變等方法，驗證ABHD5介導(dǎo)細(xì)胞自噬改變調(diào)控結(jié)腸上皮細(xì)胞染色質(zhì)穩(wěn)定性改變及腫瘤發(fā)生的作用。
　　2、利用人結(jié)腸上

7、皮細(xì)胞CCD841CoN，F(xiàn)HC為模型，結(jié)合免疫熒光，CoIP，GST-pulldown等實驗方法，闡明ABHD5與Caspase3競爭自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1的剪切位點調(diào)控細(xì)胞自噬水平的分子機制。
　　3、基于慢病毒載體構(gòu)建ABHD5高低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系，結(jié)合高效液相色譜法，代謝組學(xué)分析檢測，核素標(biāo)記的14C-FU示蹤等方法探索ABHD5調(diào)控自噬相關(guān)尿嘧啶合成介導(dǎo)5-FU耐藥的作用及機制。
　　4、利用Gene Exp

8、ression Omnibus數(shù)據(jù)庫中GES29582，GES17536兩個數(shù)據(jù)集中的全基因表達(dá)譜及臨床資料構(gòu)建發(fā)現(xiàn)集，結(jié)合由我院收治的222例結(jié)腸癌患者組成的驗證集，分析Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌ABHD5基因表達(dá)與5-FU輔助化療療效的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、ABHD5缺失導(dǎo)致正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和腺瘤細(xì)胞自噬水平顯著降低、DNA修復(fù)能力減弱、基因組不穩(wěn)定性明顯增強，促進(jìn)腫瘤發(fā)生;在腸道特異性敲除ABHD5的APCmin/+腸道腺瘤

9、小鼠模型中，ABHD5缺失可通過抑制細(xì)胞自噬反應(yīng)促進(jìn)腺瘤癌變。
　　2、ABHD5可與Caspase3競爭自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1的ASP124，ASP133，ASP149三個剪切位點，并以此調(diào)控Beclin1的剪切活性介導(dǎo)細(xì)胞自噬水平改變。結(jié)腸上皮細(xì)胞由于ABHD5基因缺失，促進(jìn)Caspase3與Beclin1的結(jié)合，上調(diào)Beclin1剪切活性，導(dǎo)致Beclin1被剪切為N端片段與C端片段，失去誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的能力，促進(jìn)腫瘤發(fā)生

10、。利用Beclin1的特異性激動劑上調(diào)Beclin1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的活性，可在小鼠體內(nèi)回復(fù)ABHD5缺失后的促腫瘤發(fā)生效應(yīng)。
　　3、ABHD5基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞自噬相關(guān)尿嘧啶補救合成途徑受損，內(nèi)源性嘧啶合成減少，當(dāng)給予5-FU處理時，細(xì)胞誤將5-氟尿嘧啶作為DNA合成底物大量攝取進(jìn)入細(xì)胞，上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU的藥物敏感性，促進(jìn)細(xì)胞死亡。
　　4、人結(jié)腸癌組織中ABHD5表達(dá)與Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌患者5-FU輔助化療療效具有相關(guān)性

11、。ABHD5缺失的患者預(yù)后較差，但該類患者可從5-FU輔助化療中獲益，而ABHD5高表達(dá)的患者其本身預(yù)后較好，經(jīng)5-FU輔助化療后DFS卻明顯縮短。
　　結(jié)論:
　　1、ABHD5缺失導(dǎo)致正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和腺瘤細(xì)胞自噬水平顯著降低、DNA修復(fù)能力減弱、染色體不穩(wěn)定性顯著增強，促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)生。
　　2、ABHD5可競爭性結(jié)合Beclin1的Caspase3剪切位點，通過非PNPLA2依賴的代謝途徑調(diào)控Beclin1介導(dǎo)的