Periostin基因在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和耐藥性中的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一章:Periostin基因在人結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義
　　目的:結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高結(jié)腸癌患者生存率的關(guān)鍵所在。目前有很多非侵入性結(jié)腸癌篩查方法，血清癌胚抗原(CEA)篩查是最常見的方法之一。然而，CEA診斷結(jié)腸癌的敏感性和特異性較低。Periostin是最近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞基質(zhì)蛋白，在多種組織尤其是在惡性腫瘤組織內(nèi)過表達(dá)。本部分的研究目的為確定Periostin在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床

2、意義。
　　方法:健康對(duì)照組:隨機(jī)挑選來我院體格檢查正常者共12例，其中男性6例，女性6例，年齡48-75歲。結(jié)腸癌病人組:隨機(jī)挑選2011年4月-2012年4月住院的20例結(jié)腸癌患者，年齡38-81歲，平均年齡為62歲，男性13例，女性7例。所有病例均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前CEA檢測(cè)資料齊備，并且未接收任何術(shù)前放化療。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例(55％)、肝轉(zhuǎn)移6例、肺轉(zhuǎn)移1例，組織學(xué)分化程度有高分化、中分化、低分化各5、7、8例。臨床

3、病理TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期分別為5、4、4和7例。正常癌旁組織為取自同一手術(shù)切除標(biāo)本且距腫瘤邊緣約5-8cm。分別應(yīng)用半定量RT-PCR和Westernblot法檢測(cè)結(jié)腸癌組織和正常組織中Periostin基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)結(jié)腸癌患者和正常對(duì)照血清Periostin濃度，并分析血清Periostin濃度與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:結(jié)腸癌組織中Periosti

4、n mRNA豐度明顯高于癌旁正常組織。經(jīng)過灰度分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中Periostin/GAPDH的值為1.35±0.61，而在癌旁正常組織中Periostin/GAPDH的值為0.33±0.21。兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明:Periostin蛋白質(zhì)的表達(dá)量在結(jié)腸癌中顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織(P＜0.05)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌病人血清中Periostin蛋白含量顯著

5、高于對(duì)照組正常人血清中Periostin的含量，分別為55.04±11.50ng/mL和23.31±6.72ng/mL，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05)。血清Periostin濃度與結(jié)腸癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移以及TNM分期顯著相關(guān)，濃度越高，腫瘤惡性度越高。然而，其血清濃度與病人年齡、性別、腫瘤大小和血清CEA水平無明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論:Periostin基因在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)。結(jié)腸癌病人血清Periostin濃度顯

6、著高于健康正常人。血清Periostin濃度與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和高級(jí)別腫瘤分期顯著相關(guān)。
　　第二章:Periostin基因在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制
　　目的:遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡的重要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲能力的一個(gè)關(guān)鍵事件。本部分研究目的為檢測(cè)Periostin對(duì)細(xì)胞增殖、集落形成、粘附、侵襲、EMT等生物學(xué)行

7、為的影響。
　　方法:應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從結(jié)腸癌組織中擴(kuò)增全長(zhǎng)人PeriostincDNA，并將其克隆至pcDNA3.1(+)表達(dá)載體，構(gòu)建人Periostin基因真核表達(dá)質(zhì)粒。將pcDNA3.1-Periostin重組質(zhì)?；蚩蛰d體分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW480，應(yīng)用G418篩選，建立Periostin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖改變;應(yīng)用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞形成集落的能力;應(yīng)用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞

8、黏附能力的改變;應(yīng)用體外侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲能力的改變。倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染空載體或Periostin表達(dá)質(zhì)粒SW480細(xì)胞形態(tài)變化，并應(yīng)用Western blot法檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:與未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的結(jié)腸癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Periostin重組質(zhì)粒結(jié)腸癌細(xì)胞Periostin水平顯著增加，提高大約8-10倍。轉(zhuǎn)染Perios

9、tin重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒及未轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞增殖速度類似，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。pcDNA3.1-Periostin轉(zhuǎn)染SW480和HT-29細(xì)胞集落形成率分別為78±7％和67±13％，而轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照SW480和HT-29細(xì)胞集落形成率分別為80±14％和64±11％，經(jīng)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。應(yīng)用體外細(xì)胞與基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)，通過酶標(biāo)儀在570nm測(cè)定吸光度值，觀察對(duì)照組細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)Ⅰ型膠原蛋白粘附

10、能力的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的OD值均顯著高于對(duì)照組OD值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05): SW480對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組OD值分別為0.43±0.09和0.77±0.08; HT-29對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組OD值分別為0.59±0.09和0.94±0.09。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體的SW480細(xì)胞（對(duì)照組）培養(yǎng)24 h后穿膜細(xì)胞數(shù)為51±7個(gè)/視野;Periostin表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)24 h后穿膜細(xì)胞數(shù)達(dá)到98±9個(gè)/視野

11、，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示對(duì)照組SW480細(xì)胞仍保持上皮細(xì)胞形態(tài)，而轉(zhuǎn)染Periostin重組質(zhì)粒細(xì)胞則變?yōu)殚L(zhǎng)梭狀，為典型的間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。Periostin轉(zhuǎn)染細(xì)胞E-cadherin表達(dá)量下降而Vimentin蛋白表達(dá)量明顯增加。
　　結(jié)論:Periostin基因在結(jié)腸癌中具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞粘附和侵襲的能力以及誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的能力。但Periostin基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增

12、殖和成瘤能力影響不顯著。
　　第三章:Periostin基因在結(jié)腸癌耐藥性中的作用及機(jī)制
　　目的:目前廣泛用于結(jié)腸癌化療的藥物主要有三種，即氟尿嘧啶(Fluoropyrimidines)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)和伊立替康(Irinotecan)。它們可以單獨(dú)使用也可以聯(lián)用。本部分研究目的為揭示Periostin基因在結(jié)腸癌耐藥性中的功能并探討相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法:Oxaliplatin或5-FU處理S

13、W480和HT-29細(xì)胞0-48 h后，應(yīng)用Western blot和RT-PCR法分別檢測(cè)Periostin蛋白和mRNA表達(dá)水平。SW480和HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染Periostin siRNA或?qū)φ誷iRNA，24小時(shí)后加入Oxaliplatin或5-FU處理48小時(shí)后，應(yīng)用Annexin-(Ⅴ)染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡，并應(yīng)用Western blot法測(cè)定切割型caspase-3和PARP以及Survivin蛋白表達(dá)水平。應(yīng)用PCR法擴(kuò)增

14、全長(zhǎng)人survivin基因，并將其克隆至真核表達(dá)載體，構(gòu)建Survivin重組質(zhì)粒。survivin基因與Periostin siRNA共轉(zhuǎn)染SW480和HT-29細(xì)胞，孵育24小時(shí)后，應(yīng)用Oxaliplatin或5-FU處理48小時(shí)，應(yīng)用Annexin-(Ⅴ)染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡的變化。SW480和HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染Periostin表達(dá)質(zhì)粒24小時(shí)后，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)Survivin、總Akt和磷酸化Akt蛋白水平。

15、應(yīng)用PI3K特異抑制劑LY294002(20μM)預(yù)處理SW480和HT-29細(xì)胞1小時(shí)，然后再轉(zhuǎn)染Periostin表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用Western blot法測(cè)定Survivin蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:Oxaliplatin和5-FU處理SW480和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞24h和48 h后可明顯誘導(dǎo)Periostin蛋白和mRNA水平增加。轉(zhuǎn)染PeriostinsiRNA可顯著抑制藥物誘導(dǎo)的Periostin表達(dá)上調(diào)。Ann

16、exinⅤ—FITC和PI雙染法顯示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA組相比，siRNA法引起的Periostin基因表達(dá)下調(diào)可顯著增強(qiáng)Oxaliplatin和5-FU誘導(dǎo)的SW480細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞比例分別從10％和7％升至18％和20％。在HT-29細(xì)胞中可觀察到類似的現(xiàn)象，Oxaliplatin和5-FU誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞百分比分別從對(duì)照組的6％和9％升至實(shí)驗(yàn)組的15％和22％。Western blot結(jié)果顯示，在化學(xué)藥物刺激條件下，轉(zhuǎn)染Per

17、iostin siRNA的SW480和HT-29細(xì)胞中切割caspase-3和PARP蛋白水平較對(duì)照細(xì)胞顯著增加，而Survivin蛋白水平較對(duì)照組細(xì)胞明顯降低。過表達(dá)Survivin基因顯著抑制Oxaliplatin或5-FU誘導(dǎo)的Periostin基因沉默結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，與未轉(zhuǎn)染Survivin表達(dá)質(zhì)粒組相比，凋亡率下降了約50％。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，Periostin過表達(dá)可導(dǎo)致SW480和HT-29細(xì)胞中Ak