氧化還原相關基因hRRM2及COX2在大腸癌發(fā)生發(fā)展的作用.pdf

1、目的：
　　研究多基因組合——人核糖核苷酸還原酶M2亞基（hRRM2）、Polo樣激酶1（PLK1）、誘導型環(huán)氧化酶（COX-2）和趨化因子CXCL16在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及在結(jié)腸直腸癌放射增敏作用中的作用機制機理。同時研究特異性COX-2抑制劑——塞來昔布對大腸癌細胞與血管內(nèi)皮細胞粘附作用的影響及其分子機制。
　　方法：
　?。?）細胞株來源及臨床標本取材：課題共選取SW1116、SW620、SW480、HT

2、-29、HCT116、LoVo、Caco-2、Colo205等8株人結(jié)腸癌細胞系。結(jié)直腸癌組織標本取自上海市微創(chuàng)外科臨床醫(yī)學中心（2007年~2009年），組織芯片共112點，取自56例結(jié)直腸患者的腫瘤組織和癌旁組織。
　?。?）應用免疫組化技術對大腸癌組織芯片（Tissue microarray）進行染色評估，觀察hRRM2、PLK1、COX-2在結(jié)腸直腸癌組織中的表達情況；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連反應（PCR）和免疫印跡（Weste

3、rnblot）技術分別檢測多基因hRRM2、PLK1、COX-2、CXCL16及在mRNA及蛋白水平的表達情況。
　?。?）培養(yǎng)HCT116，SW480和SW1116等7株大腸癌細胞株用siRNA分別下調(diào)RRM2、PLK1的表達，應用細胞增殖毒性檢測試劑盒(Cell Count Kit-8)檢測轉(zhuǎn)染后大腸癌細胞的增殖水平，流式細胞儀V-FITC（異硫氰酸熒光素）/碘化丙啶（PI）雙標記法分析干擾組（siRNA）、陰性對照組、空白對

4、照組對大腸癌細胞株HCT116凋亡的影響。
　　（4）應用劃痕實驗研究HCT116分別轉(zhuǎn)染siRRM2和siPLK1后結(jié)腸直腸癌細胞的遷移能力變化，應用Transwell小室實驗評估分別轉(zhuǎn)染siRRM2和siPLK1后結(jié)腸直腸癌細胞的侵襲能力變化。
　?。?）將shRRM2和shPLK分別1處理后的結(jié)腸直腸癌細胞置于紫外線光源的照射下，觀察相應基因抑制特別是核糖核苷酸還原酶M2亞基表達抑制后細胞對紫外線輻射的致敏作用。

5、>　?。?）應用流式細胞技術分選GFP標記的腸癌細胞株，并用細胞粘附實驗和流式細胞儀觀察塞來昔布對于腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞粘附的影響；應用免疫印跡法觀察相關粘附分子的表達情況。應用血管形成實驗觀察CXCL16對于血管內(nèi)皮細胞HUVEC細胞的成血管作用。應用免疫熒光實驗觀察CXCL16和CXCR6在大腸癌細胞株中的表達定位
　　結(jié)果：
　?。?）結(jié)腸直腸癌組織中RRM2的表達明顯高于癌旁正常組織(P<0．05)，且與浸潤深度(P<

6、0.05)、低分化程度(P=0.0051)、TNM分期(P=0.0015)均具相關性；PLK1在其中的41例中過表達，蛋白表達水平與腫瘤浸潤深度和大腸癌分化程度具有相關性。而COX-2基因與腫瘤TNM的分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關。
　?。?）抑制hRRM2、PLK1表達后，其增殖能力較對照組明顯下降（P<0.05)
　?。?）在遷徙實驗中和侵襲實驗中，抑制hRRM2、PLK1表達后，大腸癌細胞HCT116的遷徙和侵襲能力均受到抑制。

7、
　?。?）hRRM2 shRNA處理細胞后，細胞免疫組化方法染色可見處理前細胞高表達RRM2蛋白，shRNA處理后細胞RRM2蛋白的表達水平明顯下降。RRM2–/–腫瘤細胞和RRM2敲除后腫瘤細胞對紫外輻射的敏感性顯著增加。用shRRM2處理大腸癌細胞后，紫外輻射下克隆形成能力顯著抑制。shRRM2組aP<0.05 vs HCT116組（6J），bP<0.05 vs HCT116組(8J)，cP<0.05 vs HCT116組(

8、10J)，dP<0.05 vs HCT116組(12J)。8J、48h后HCT116細胞仍然保持較好的貼壁和粘附狀態(tài)，而經(jīng)過RRM2干擾處理的HCT116細胞則呈現(xiàn)出凋亡形態(tài)免疫熒光染色觀察UV照射前后，RRM2的表達位置。UV照射前，RRM2主要分布于細胞胞質(zhì)當中，經(jīng)UV照射2h后，RRM2蛋白逐漸在細胞核中表達。與未經(jīng)UV處理的細胞相比,五個鏡野下細胞核呈現(xiàn)RRM2表達的細胞數(shù)均值從4增加至28,差異具有統(tǒng)計學意義。
　　（5

9、）塞來昔布對兩種細胞間的粘附作用有抑制作用并且與兩種細胞間的粘附抑制率呈劑量依賴關系。不同時間點（4h后，6h后，8h后）、不同濃度梯度藥物對細胞間粘附率的影響顯示，塞來昔布對兩種細胞間的粘附抑制率與藥物濃度呈依賴關系（P<0.05)，且10μM，15μM的粘附抑制率顯著高于上述組別，統(tǒng)計學分析有顯著性差異（P<0.05)。
　?。?）分別用4μM，6μM，10μM塞來昔布處理Caco-2細胞8h后，觀察細胞中VCAM-1蛋白的表

10、達情況，Western blot檢測顯示隨著藥物濃度增加，VCAM-1蛋白的表達呈下降趨勢，當塞來昔布濃度達到10μM時，Caco-2細胞幾乎觀察不到VCAM-1蛋白的表達。
　　結(jié)論：
　　hRRM2、PLK1、COX-2在大腸癌組織中呈高表達，且均與大腸癌的腫瘤浸潤深度和放射增敏作用相關。抑制hRRM2、PLK1都可降低人結(jié)腸直腸癌細胞的增殖、凋亡、遷徙、侵襲等腫瘤生物學行為；下調(diào)核糖核苷酸還原酶M2表達后結(jié)腸直腸癌細胞