IGFs基因沉默對梅花鹿鹿茸軟骨及間充質(zhì)細(xì)胞生長發(fā)育的作用機制研究.pdf

1、本研究以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreen plasmid為載體，以IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ作為候選基因研究其對鹿茸生長的作用機制，針對候選基因各構(gòu)建三個RNAi重組質(zhì)粒，分別命名為pshRNA1-1、pshRNA1-2、pshRNA1-3和pshRNA2-1、pshRNA2-2、pshRNA2-3，轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用Real-Time PCR和Western blot技術(shù)，對轉(zhuǎn)染48h后的RNA

2、i效果進行分析，篩選得到抑制效果最好的干擾組。用于研究目的基因?qū)β谷总浌羌?xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡、周期及自身mRNA和蛋白表達(dá)的作用，探討鹿茸生長調(diào)節(jié)機制。研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 (1)所構(gòu)建的三個IGF-ⅠRNAi質(zhì)粒均可顯著降低鹿茸軟骨細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞目的基因的表達(dá)量。其中，pshRNA1-1、pshRNA1-2、pshRNA1-3分別降低了IGF-Ⅰ的mRNA和蛋白表達(dá)水平，且pshRNA1-2的干擾效果最好，對IG

3、F1 mRNA的抑制率達(dá)到60％以上。
　　 (2)所構(gòu)建的三個IGF-ⅡRNAi質(zhì)粒均可顯著降低鹿茸軟骨細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞目的基因的表達(dá)量。其中，pshRNA2-1、pshRNA2-2、pshRNA2-3分別降低IGF-Ⅱ的mRNA表達(dá)水平，且pshRNA2-2的干擾效果最好，對IGF2 mRNA的抑制率達(dá)到60％以上。
　　 (3)采用MTT方法檢測轉(zhuǎn)染48h細(xì)胞的增殖情況，軟骨細(xì)胞實驗組pshRNA1-2和pshRN

4、A2-2、空白對照組、陰性對照組的增殖率分別為16.97±9.83％、19.13±8.11％、24.59±10.22％、22.11±10.19％;間充質(zhì)細(xì)胞實驗組、空白對照組、陰性對照組的增殖率分別為22.63±11.22％、23.46±12.77％、29.46±12.88％、28.02±15.69％;結(jié)果表明軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的增殖均受到抑制。
　　 (4)應(yīng)用(V)-APC凋亡檢測試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的凋亡

5、情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h后，空白對照組、實驗組pshRNA1-2、pshRNA2-2和陰性對照組pshRNA-negative的早期凋亡率分別為0.46±0.39％、14.45±3.39％、23.64±2.81％、0.67±0.24％，差異極顯著(p＜0.01);間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后空白對照組、實驗組pshRNA1-2、 pshRNA2-2和陰性對照組pshRNA-negative的早期凋亡率分別為4.40±2.05％、25.78±5.8

6、7％、38.15±16.66％、6.32±3.03％，差異極顯著(p＜0.01)。表明轉(zhuǎn)染pshRNA1-2和pshRNA2-2可以促進軟骨細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞凋亡。
　　 (5)利用流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后48h碘化吡啶處理的細(xì)胞，檢測細(xì)胞的周期變化情況。結(jié)果顯示:軟骨細(xì)胞空白對照組S期比例為12.59±0.04％;試驗組pshRNA1-2、pshRNA2-2為7.19±0.03％、7.12±0.05％;陰性對照組為8.70±0.03

7、％。間充質(zhì)細(xì)胞空白對照組S期比例為9.47±3.56％;實驗組pshRNA1-2、 pshRNA2-2為4.95±0.48％、3.48±4.74％;陰性對照組為8.28±2.98％。發(fā)現(xiàn)無論是在軟骨細(xì)胞還是間充質(zhì)細(xì)胞中，pshRNA1-2和pshRNA2-2均可使S期細(xì)胞減少。
　　 結(jié)果表明，IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在鹿茸的生長過程中起著重要的調(diào)控作用，特別是對鹿茸軟骨及間充質(zhì)細(xì)胞的增殖、凋亡有顯著的調(diào)節(jié)作用，其次通過調(diào)控軟骨及