胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎樣模型的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:(1)分離培養(yǎng)人胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞(placenta mesenchymal stem cells,PMSCs)備用;(2)建立特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)樣動(dòng)物模型;(3)探討PMSCs對(duì)小鼠AD樣皮損的影響;(4)探討PMSCs對(duì)AD樣動(dòng)物模型引流淋巴結(jié)和脾臟中Foxp3+Treg數(shù)量的影響;(5)PMSCs在小鼠AD樣模型中對(duì)皮損IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-

2、γ的影響及機(jī)制。
　　方法:(1)PMSCs分離用組織塊法聯(lián)合酶消化法,鑒定采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子,體外誘導(dǎo)其分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞;(2)用1％5-異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)誘發(fā)BALB/c小鼠建立急性(激發(fā)1次)和慢性(每3d激發(fā)1次,共7次)AD樣模型;(3)靜脈注射不同劑量的PMSCs(0.5×106,1×106或2×106個(gè)/次/只)治療小鼠急(

3、1次)、慢性(2次)AD樣模型,肉眼觀察小鼠耳朵和背部皮膚的變化,動(dòng)態(tài)測(cè)量小鼠耳厚度,處死前稱重,處死后稱其耳和脾臟重量,計(jì)算左右耳的重量差以及脾臟指數(shù);(4)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟及耳部引流淋巴結(jié)的Foxp3+Treg細(xì)胞;(5)用流式細(xì)胞儀微球捕獲芯片技術(shù)法(CBA)檢測(cè)小鼠背部皮膚組織勻漿中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ含量;(6)小鼠耳朵和背部皮膚進(jìn)行常規(guī)組織病理切片和HE染色,光鏡

4、下觀察其皮膚病理改變,并計(jì)算表皮層數(shù)和真皮中的炎癥細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果:
　　(一)成功分離、鑒定、擴(kuò)增PMSCs
　　PMSCs表面表達(dá)CD29、CD90、CD105,CD34、CD45、HLA-DR為陰性,PMSCs體外誘導(dǎo)可分化為成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞。
　　(二)成功建立小鼠AD樣模型
　　(1)急性AD樣模型激發(fā)前左耳厚度(24.90±0.89)×10-3mm,激發(fā)12h后耳廓和背部皮膚可

5、見(jiàn)輕度水腫性紅斑,24h后厚度達(dá)到(28.00±1.06)×10-3mm,48h時(shí)達(dá)高峰(28.70±0.67)×10-3mm,此時(shí)左耳重量為(13.88±0.61)mg,左右耳的重量差為(0.84±0.72)mg。耳和背部皮膚的組織病理變化類似急性皮炎,表現(xiàn)為表皮輕微水腫和增厚,真皮淺層水腫,小血管擴(kuò)張,較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(主要是單一核細(xì)胞和少許多形核細(xì)胞),與基質(zhì)組比較,耳和背部的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)、背部的表皮層數(shù)增多(

6、P<0.05)。模型組小鼠皮損中Th1、Th2細(xì)胞因子均升高,IFN-γ/IL-4比值比基質(zhì)組下降,此小鼠中出現(xiàn)以Th2占優(yōu)勢(shì)的Thl/Th2的平衡失調(diào)。
　　(2)慢性AD樣模型第1次激發(fā)前左耳厚度(27.00±1.27)×10-3mm,第1次激發(fā)12h后即出現(xiàn)輕度水腫性紅斑,隨著激發(fā)次數(shù)的增多,水腫性紅斑逐漸加重,并可見(jiàn)滲出結(jié)痂、鱗屑和毛發(fā)脫落(主要見(jiàn)于背部),第28d(處死前)耳厚度為(39.30±4.15)×10-3mm,

7、左耳重量為(19.60±3.86)mg,左右耳的重量差為(5.24±3.26)mg。光鏡下皮膚呈亞急性和慢性皮炎樣改變:耳部皮膚可見(jiàn)表皮角質(zhì)層較明顯增厚,偶見(jiàn)血清痂,棘層增厚(4~5層),真皮內(nèi)有大量的細(xì)胞浸潤(rùn)(主要是單一核細(xì)胞和少許多形核細(xì)胞);背部皮膚表現(xiàn)為表皮顯著角化過(guò)度,角化不全,棘層明顯增厚(6~8層),有細(xì)胞外移,偶見(jiàn)血清痂,真皮內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(主要是單一核細(xì)胞),與基質(zhì)組相比,浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)和棘層層數(shù)均明顯增多(P<0.

8、05~0.01)。模型組小鼠皮損中IFN-γ/IL-4比值仍低于基質(zhì)組,Th2占優(yōu)勢(shì)的Thl/Th2的平衡失調(diào)依然存在。
　　(三)PMSCs對(duì)小鼠AD樣模型的影響
　　(1)急性小鼠AD樣模型激發(fā)后24h時(shí),PMSCs注射的高劑量組小鼠耳厚低于模型組(P<0.05),中劑量組亦小于模型組,但差異無(wú)顯著性(P>0.05),48h時(shí),中、高劑量組的耳厚度小于模型組(P<0.05)。其效果與劑量呈正相關(guān);PMSCs中、高劑量組的

9、耳重量小于模型組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在組織病理片上,中、高劑量組耳和背部皮膚中的真皮浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)和背部表皮的層數(shù)均低于模型組(P均<0.05),表明PMSCs對(duì)急性AD樣皮損有治療作用;
　　(2)慢性小鼠AD樣模型 PMSCs高劑量組在激發(fā)1d后與模型組相比耳厚度小于模型組(P<0.05),在4d后中、高劑量組耳的厚度均小于模型組(P<0.05),且高劑量的療效好于低劑量組;PMSCs各劑量組耳重量均輕于模型組,但無(wú)

10、顯著性差異(P>0.05)。組織病理學(xué)方面,高劑量組的耳和背部皮膚真皮中浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)以及背部的表皮厚度小于模型組(P<0.05),中劑量組的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)亦低于模型組(P<0.05);此外,高劑量組真皮內(nèi)的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)和背部表皮的厚度小于中劑量組(P均<0.05),說(shuō)明PMSCs對(duì)慢性小鼠AD樣皮損亦有治療作用,且其療效與細(xì)胞濃度有關(guān)。
　　(四)PMSCs對(duì)小鼠AD樣模型中Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量的影響
　　中、高劑量PMSC

11、s可促進(jìn)AD樣小鼠急性期引流淋巴結(jié)中Foxp3+Treg的生成,對(duì)脾臟中Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯影響。
　　(五)各組小鼠皮損中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ的變化
　　(1)與急性基質(zhì)對(duì)照組相比,急性模型組皮損中Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平顯著升高,Th1型細(xì)胞因子IL-2升高、IFN-γ無(wú)明顯變化,炎性因子TNF顯著升高, Th17細(xì)胞特異性標(biāo)志

12、IL-17A顯著升高(P<0.05),模型組IFN-γ/IL-4(1.32±0.76)低于基質(zhì)組(2.11±0.86),提示該模型是由Th2型免疫反應(yīng)所致。
　　(2)與慢性基質(zhì)對(duì)照組相比,慢性模型組皮損中Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平升高,Th1型細(xì)胞因子IFN-γ輕度升高、IL-2無(wú)明顯變化,炎性因子TNF顯著升高, Th17細(xì)胞特異性標(biāo)志IL-17A無(wú)明顯改變,慢性組IFN-γ/IL-4(0.73±0.6

13、4)小于基質(zhì)組(1.34±0.41),提示該慢性模型組亦是以Th2型免疫反應(yīng)為主。
　　(3)地塞米松對(duì)小鼠AD樣模型治療的作用機(jī)制
　　地塞米松可顯著抑制急性小鼠AD樣模型皮損中IL-2、IL-4水平,輕微減少TNF、IFN-γ的產(chǎn)生,對(duì)IL-6、IL-10無(wú)明顯影響,使IFN-γ/IL-4(2.76±3.53)升高,使皮損中的炎性因子TNF減少以及IL-17A下降,表明地塞米松可以通過(guò)調(diào)控Th1/Th2細(xì)胞的失衡來(lái)減輕皮

14、損炎癥。
　　(4)PMSCs對(duì)小鼠AD樣模型治療的作用機(jī)制
　　①與急性模型組比較,低、中劑量PMSCs引起小鼠急性AD樣模型皮膚中Th2細(xì)胞因子IL-6、IL-10明顯下降,中劑量組中IL-4下降,低劑量組中IL-4無(wú)明顯改變,而高劑量組致使皮損中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17A升高;使低、中劑量組的IFN-γ/IL-4(0.86±0.28、0.97±0.22)減少,高劑量組的(2.1

15、2±1.55)升高,并趨于正常,提示PMSCs對(duì)Th1、Th2、Th17的影響隨著濃度的高低可能具有雙向調(diào)節(jié)作用,且與細(xì)胞濃度相關(guān)。
　　②與慢性模型組比較,PMSCs可使皮損中的IL-10和TNF減少,但對(duì)其他因子無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:
　　(1)成功分離PMSCs;
　　(2)用1％FITC誘導(dǎo)BALB/c小鼠成功建立以Th2型免疫反應(yīng)為主的急、慢性AD樣模型;
　　(3)靜脈給予PMSCs可減輕小鼠