齊墩果酸對樹突狀細(xì)胞影響的實驗研究.pdf

1、目的：建立外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）以及細(xì)胞因子活化的T細(xì)胞培養(yǎng)體系，初步探討經(jīng)齊墩果酸（oleanolic acid，OA）處理的DC對活化T細(xì)胞的影響。體外檢測經(jīng)不同濃度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml）齊墩果酸處理后的DC細(xì)胞膜表面標(biāo)志、形態(tài)以及細(xì)胞因子分泌的異同。
　　方法：取健康成人外周血，分離單個核細(xì)胞（peripheral blood

2、mononuclear cells，PBMC），用細(xì)胞因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導(dǎo)培養(yǎng)并獲得DC；以細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素1α（IL-1α）、干擾素-γ（IFN-γ）以及CD3單克隆抗體（CD3McAb）刺激制備活化T細(xì)胞；在DC細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)添加不同濃度的OA，分別記為OA-DC-I組（25μg/ml）、OA-DC-II組(50μ

3、g/ml)、OA-DC-III組(100μg/ml)、OA-DC-IV組(200μg/ml)。培養(yǎng)至7天用流式細(xì)胞學(xué)檢查DC細(xì)胞膜標(biāo)志；酶聯(lián)免疫斑點測定法（enzyme-linked immunospot assay.ELISPOT）檢測DC對活化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1. DC形態(tài)及表型分析，比較OA對DC表型的影響：
　　DC形態(tài)觀察：從健康成人外周血分離單核細(xì)胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，貼壁

4、細(xì)胞用于誘導(dǎo)生成DC。培養(yǎng)至第7天倒置顯微鏡下可見部分細(xì)胞變大，不規(guī)則，伸出偽足，呈典型樹突狀細(xì)胞。
　　DC表型分析：流式細(xì)胞儀檢測DC以及OA-DC表面分子表達(dá)情況。培養(yǎng)第7天DC細(xì)胞表面分子CD86/CD80、CD83和HLA-DR表達(dá)分別為：DC組1355.88±2880.12，92.21±18.19和1034+279.18； OA-DC-Ⅰ組1298.54±198.87，91.22±18.70和1166.76+267.7

5、8； OA-DC-Ⅱ組1143.77±201.32，90.09±17.65和1105.54+251.78；OA-DC-Ⅲ組897.54±197.45，68.11±18.20和503.57+98.02； OA-DC-Ⅳ組564.33±187.69，8.89±2.21和21.37+2.02。與 DC細(xì)胞比較，OA可以顯著降低CD86+/CD80+表達(dá)（P<0.05）。HLA-DR+和CD83的表達(dá)在DC、OA-DC I組和II組之間比較無顯

6、著性差異（P>0.05），但隨著OA濃度的增加，其表達(dá)量顯著降低，DC細(xì)胞、OA-DC III組和IV組有極顯著差異（p<0.01），這說明OA可以抑制DC成熟。
　　2. ELISPOT法檢測OA處理后的DC對活化T細(xì)胞分泌IFN-γ的影響：
　　計數(shù)并調(diào)整好細(xì)胞濃度，在已包被好的ELISPOT板中分別加入經(jīng)不同濃度OA處理的DC與活化T細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISPOT READER定量檢測發(fā)現(xiàn)，IFN-γ分泌量隨著OA濃度的增