齊墩果酸誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡及對(duì)PTEN表達(dá)的影響.pdf

1、目的:本文旨在觀察齊墩果酸(OA)對(duì)人T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞株的誘導(dǎo)凋亡作用以及對(duì)PTEN表達(dá)的影響，分析可能的機(jī)制，為臨床急性淋巴細(xì)胞白血病及淋巴瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)于含10％小牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2天傳代1

2、次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
　　 二、CCK8法檢測(cè)OA對(duì)Jurkat細(xì)胞的增殖抑制率
　　 實(shí)驗(yàn)分六個(gè)組，不加藥對(duì)照組、20μmol/L OA組、40μmol/L OA組、80μmol/LOA組、160μmol/L OA組、320μmol/L OA組，實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，12h、24h、48h，應(yīng)用CCK8法檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間點(diǎn)作用后細(xì)胞的存活率，并計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率。
　　 三、Annexin

3、V/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　　 分別收集40、80和160μmol/L OA處理24h的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，明確OA對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響。
　　 四、Hoechst33258染色共聚焦顯微鏡觀察
　　 40、80和160μmol/L濃度的OA作用細(xì)胞24h，收集細(xì)胞，經(jīng)Hoechst33258染色后共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變，進(jìn)行圖像采集。
　　 五、PTEN m

4、RNA表達(dá)的實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)
　　 40、80和160μmol/L OA處理24h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到對(duì)應(yīng)的cDNA。應(yīng)用RealTimePCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，記錄循環(huán)閾值（Ct值），計(jì)算PTEN基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　 六、Westernblot分析PTEN蛋白的表達(dá)
　　 40、80和160μmol/L OA處理細(xì)胞24h，裂解細(xì)胞，提取蛋白，提取的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分

5、離，電轉(zhuǎn)到PVC膜上，WesternBlot檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、在20μmol/L-320μmol/L濃度范圍內(nèi)OA均能抑制Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與藥物濃度及給藥時(shí)間均呈正相關(guān)。
　　 2、OA能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，40、80和160μmol/L的OA作用24h后細(xì)胞的特異性凋亡率(％)分別為(19.8±0.22)％、(28.72±0.25)％、(30.12±0

6、.99)％，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、共聚焦顯微鏡觀察不同濃度的OA作用細(xì)胞24h后各組出現(xiàn)細(xì)胞核逐漸濃縮，160μmol/L濃度組可見(jiàn)核碎片，呈凋亡征象。
　　 4、RT-PCR結(jié)果顯示80μmol/L和160μmol/L濃度的OA作用Jurkat細(xì)胞24h后PTEN基因表達(dá)量均有升高，分別約為對(duì)照組的1.77倍和1.79倍。
　　 5、Western Blot結(jié)果表明OA能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞中