齊墩果酸衍生物SZC015誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌凋亡及自噬的作用機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　齊墩果酸(Oleanolic Acid，OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于多種類型的天然植物中。但其藥理活性相對(duì)較弱，生物利用度較低，限制了其進(jìn)一步研究與應(yīng)用。本研究中，我們從OA衍生物SZC009，SZC014和SZC015中篩選出最佳抗腫瘤活性衍生物 SZC015，并對(duì)其體外抗非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)作用及其潛在的分子機(jī)制進(jìn)行了探究。
　　方

2、法：
　　（1）MTT法檢測(cè)不同濃度OA及其衍生物SZC009、SZC014、SZC015對(duì)人NSCLC系A(chǔ)549、H1299和H322以及人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE的生存率影響；（2）分別使用光學(xué)顯微鏡和電子透射顯微鏡觀察SZC015誘導(dǎo)H322細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬的形態(tài)學(xué)變化；（3）倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化；（4）流式AV-PI雙染法檢測(cè)SZC015對(duì)H322細(xì)胞凋亡百分率的影響；（5）流式PI染色法檢測(cè)SZC015

3、對(duì)H322細(xì)胞周期阻滯的影響；（6）流式DCFH-DA熒光染色法檢測(cè)SZC015處理后H322細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的變化；（7） Western blotting法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Procaspase3、Procaspase9、Bcl-2、Bax、LC3B、Akt、p-Akt、p-IκBα、P65與p-P65蛋白的表達(dá)水平；（8）免疫熒光染色法探究SZC015作用下的H322細(xì)胞內(nèi)P65蛋白的

4、核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。
　　結(jié)果：
　?。?）與空白對(duì)照組相比，SZC015能夠顯著性抑制人NSCLC A549、H1299和H322細(xì)胞增殖活性，并呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴性，而對(duì)正常的人支氣管上皮細(xì)胞HBE的抑制增殖作用較弱，表明SZC015對(duì)NSCLC的細(xì)胞增殖具有選擇性抑制作用。（2）與空白對(duì)照組相比，SZC015能夠明顯改變細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增多，且呈劑量依賴性，表明SZC015能夠誘導(dǎo)H322細(xì)胞凋亡。（3）與空白對(duì)照組相

5、比，SZC015處理H322細(xì)胞后可明顯提高凋亡細(xì)胞百分比和Bax/Bcl-2的蛋白比值，降低Procaspase-3、Procaspase-9蛋白表達(dá)，表明SZC015能誘導(dǎo)H322細(xì)胞發(fā)生凋亡。經(jīng)OA處理后的H322細(xì)胞Procaspase-3蛋白表達(dá)高于SZC015，凋亡現(xiàn)象越明顯，Procaspase-3蛋白表達(dá)的程度越低，進(jìn)一步表明SZC015對(duì)H322細(xì)胞的促凋亡作用可能優(yōu)于OA。（4）與空白對(duì)照組相比，SZC015處理H3

6、22細(xì)胞后，通過(guò)電子透射顯微鏡可觀察到H322細(xì)胞胞漿中明顯呈現(xiàn)出自噬小體，并且LC3B-I向LC3B-II轉(zhuǎn)變?cè)龆?，且呈劑量依賴性，表明SZC015能誘導(dǎo)H322細(xì)胞自噬。與OA相比，SZC015誘導(dǎo)H322細(xì)胞內(nèi)LC3B-II/I蛋白表達(dá)上升，自噬現(xiàn)象越明顯，LC3B-I向LC3B-II的轉(zhuǎn)變?cè)蕉啵M(jìn)一步表明SZC015誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬的作用可能優(yōu)于OA。（5）與空白對(duì)照組相比，經(jīng)SZC015處理后，H322細(xì)胞中Akt、p-Akt

7、、p-IκBα、P65和p-P65蛋白的表達(dá)水平均明顯下降，且P65蛋白呈現(xiàn)出核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，表明SZC015可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt/NF-?B信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。（6）加入自噬抑制劑氯喹(Chloroquine，CQ)，并在SZC015的作用下，與單獨(dú)給藥組相比，Procaspase-3蛋白表達(dá)明顯下降，表明自噬可抑制凋亡。（7）與空白對(duì)照組相比，經(jīng)SZC015處理后，H322細(xì)胞中ROS含量明顯增多，表明SZC015能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成

8、。加入ROS清除劑(N-Acetyl-L-Cysteine，NAC)后，能使SZC015處理后的H322細(xì)胞中Procaspase-3和Akt蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并能降低LC3B-II/I蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)SZC015能誘導(dǎo)NSCLC H322細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬現(xiàn)象，同時(shí)SZC015也可通過(guò)抑制Akt/NF-?B信號(hào)通路而抑制細(xì)胞增殖。結(jié)果表明SZC015具有潛在的用于治療NSCL