齊墩果酸對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及分子機制研究.pdf

1、齊墩果酸（Oleanolic acid，OA）是一種天然的五環(huán)三萜類化合物，普遍存在于食物及120余種天然植物的子葉和根莖中。目前報道齊墩果酸的藥理作用包括保肝解毒、降血糖血脂、抗炎抗病毒、抗腫瘤及抗氧化等。而近年來，齊墩果酸在抗氧化方面的活性引起了人們廣泛的關(guān)注。但是，目前尚沒有文獻(xiàn)報道過齊墩果酸在體內(nèi)的抗衰老活性及可能潛在的作用機制。
　　目的：以秀麗隱桿線蟲（Caenorkabditiselegans，C.elegans）為

2、研究對象，評價齊墩果酸的延壽作用效果并探討其延壽的分子機制。
　　方法：1.壽命分析實驗：將同步化的L4期線蟲分為空白對照組（0μM）和OA給藥組（100μM、200μM、300μM、600μM）進行壽命實驗，初步判斷OA的延壽效果并篩選出最佳給藥濃度。2.壓力應(yīng)激實驗：通過氧應(yīng)激實驗和36℃熱應(yīng)激實驗，確定OA延長線蟲壽命的作用與壓力應(yīng)激反應(yīng)是否存在關(guān)聯(lián)。3.線蟲體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，RO

3、S）檢測：通過探討OA對線蟲體內(nèi)ROS的清除能力以進一步確定OA的延壽效果。4.咽泵實驗：比較3、6、10天的空白對照組與OA給藥組線蟲在15s內(nèi)的咽泵次數(shù)以及限食相關(guān)突變株壽命實驗，綜合判斷OA的延壽效果是否與熱限制機制有關(guān)。5.daf-16(mgDf50)突變株壽命實驗：探討OA對缺失daf-16基因的線蟲壽命是否存在影響。6. DAF-16亞細(xì)胞定位實驗：給藥后觀察DAF-16::GFP轉(zhuǎn)基因線蟲中DAF-16的亞細(xì)胞定位情況。7

4、. Quantitative real-time PCR實驗：OA給藥后提取線蟲內(nèi)總RNA，利用熒光定量PCR檢測daf-16及下游相關(guān)基因sod-3、ctl-1、hsp-16.2的表達(dá)量變化。
　　結(jié)果：1.通過壽命分析實驗可知OA在一定的濃度范圍內(nèi)可延長線蟲壽命，且300μM OA為最佳給藥濃度。2. OA能顯著提高線蟲在氧應(yīng)激、熱應(yīng)激環(huán)境下的生存率，證實OA延壽作用與壓力應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。3. OA能夠降低線蟲內(nèi)ROS的水平，進

5、一步說明OA具有延壽效果。4. OA不影響線蟲的咽泵頻率及限食突變株的壽命長短，從而確認(rèn)OA的延壽作用不是通過熱量限制途徑實現(xiàn)的。5.分子機制研究表明，OA促進DAF-16進入細(xì)胞核以提高DAF-16的轉(zhuǎn)錄活性，進一步啟動與衰老相關(guān)的下游基因的表達(dá)，從而延長線蟲的壽命。
　　結(jié)論：綜上所述，我們以線蟲為實驗對象，評價了OA的延壽作用并對其潛在的分子機制進行了初步探索。daf-16是一個從線蟲到哺乳動物都高度保守的壽命調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，