3-溴丙酮酸對秀麗隱桿線蟲毒性和代謝的研究.pdf

1、目的：本論文通過用不同濃度的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans），觀察藥物對秀麗隱桿線蟲毒性效應(yīng)、幼蟲發(fā)育時間的影響、脂肪含量的影響及主要相關(guān)的己糖激酶基因和 cyp-35家族基因表達(dá)水平的變化；并通過應(yīng)用目的基因RNA干擾線蟲和突變株線蟲，研究3-溴丙酮酸對秀麗隱桿線蟲的毒性和代謝的影響。
　　方法：用不同濃度的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線蟲，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察線蟲的

2、形態(tài)及幼蟲發(fā)育時間的變化；抽提線蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA用于實(shí)時熒光定量 PCR，選擇與3-溴丙酮酸毒性和代謝相關(guān)的基因—己糖激酶和cyp-35家族基因，測定相關(guān)基因的表達(dá)水平?？寺”磉_(dá)3個己糖激酶基因用于RNA干擾，同時應(yīng)用藥物代謝相關(guān)基因RNA干擾線蟲和突變株線蟲探討3-溴丙酮酸在線蟲體內(nèi)的毒性及代謝機(jī)制。
　　結(jié)果：1.2mmol/L的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線蟲，幼蟲發(fā)育時間明顯延長，與正常對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3、<0.05）。
　　2.不同濃度的3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線蟲24h后，記錄線蟲成活個數(shù)，用SPSS19.0軟件計(jì)算出藥物對線蟲的半數(shù)致死濃度為12.7mmol/L。
　　3.3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線蟲24小時后，線蟲的體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　　4.3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線蟲72小時后，線蟲頭部和腸道的脂肪儲存增加。
　　5.3-溴丙酮酸處理線蟲后，實(shí)時熒光定量 PCR測定結(jié)果顯示 hxk-

4、1、hxk-2和hxk-3的表達(dá)上調(diào)。
　　6.應(yīng)用RNA干擾的方法沉默目的基因hxk-1、hxk-2、hxk-3，其中 hxk-1、hxk-2干擾效果較好。3-溴丙酮酸作用于hxk-1、hxk-2和hxk-3干擾線蟲，LC50均降低。
　　7.通過MEGA5.05軟件和Clustal W軟件對線蟲己糖激酶基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化相似性比較，秀麗隱桿線蟲hxk-1與美洲板口線蟲己糖激酶屬于一個分支，遺傳近似度較高。秀麗隱桿線蟲hxk

5、-2和hxk-3是一個分支，hxk-2和hxk-3近似度較高，與hxk-1遺傳近似度較低。
　　8.3-溴丙酮酸處理秀麗隱桿線蟲后，實(shí)時熒光定量 PCR測定結(jié)果顯示cyp-35A1、cyp-35A2、cyp-35A4、cyp-35A5和cyp-35C1表達(dá)量均升高，其中cyp-35A1表達(dá)量升高最明顯，CYP35家族中cyp-35B3表達(dá)量降低。
　　9.3-溴丙酮酸作用于cyp-35A1突變株線蟲、cyp-35A2突變株線

6、蟲、cyp-35A4 RNA干擾線蟲和cyp-35B3 RNA干擾線蟲后，LC50均降低。
　　結(jié)論：高濃度的3-溴丙酮酸對線蟲具有毒性作用，低濃度的3-溴丙酮酸能抑制秀麗隱桿線蟲幼蟲發(fā)育，且具有濃度依賴性。線蟲體內(nèi)與3-溴丙酮酸作用相關(guān)的己糖激酶基因表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，說明當(dāng)3-溴丙酮酸抑制己糖激酶的活性時，線蟲 ATP產(chǎn)生減少，糖酵解通路反饋調(diào)節(jié)己糖激酶基因高表達(dá)，以合成更多的己糖激酶。秀麗隱桿線蟲hxk-2和hxk-3遺