應(yīng)用霉菌單加氧酶羥基化齊墩果酸的研究.pdf

1、天然產(chǎn)物化學(xué)成分齊墩果酸是五環(huán)三萜類化合物，具有保肝、降血糖、抗病毒等多種生物活性，應(yīng)用前景廣闊。但是齊墩果酸生物利用度低，制劑種類單一，限制了其生物活性的開(kāi)發(fā)。修飾改造其分子結(jié)構(gòu)，從而提高生物利用度，替代天然植物成分，達(dá)到保護(hù)環(huán)境、創(chuàng)制新藥的目的。本研究旨在采用微生物轉(zhuǎn)化法制備C11－羥基齊墩果酸，在龐大而復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)中引入C11－OH活性基團(tuán)，以便提高齊墩果酸的生物活性和提供進(jìn)一步化學(xué)修飾的可能性。 首先，通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保

2、藏的霉菌進(jìn)行篩選，得到了具有酶催化轉(zhuǎn)化齊墩果酸能力的酶源菌株赭曲霉Aspergillus ochraceus NG0216；以此為出發(fā)菌株，通過(guò)離子束誘變，篩選得到一株高產(chǎn)菌株Aspergillus ochraceus NG1203，對(duì)齊墩果酸的生物氧化轉(zhuǎn)化率由2.29％提高至6.74％，且遺傳性狀穩(wěn)定，由此得到了本課題的實(shí)驗(yàn)菌株。初步微生物催化轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)得到的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過(guò)HPLC、MS、IR、1H-NMR和13C-NMR分析，結(jié)果表

3、明產(chǎn)物為11α-羥基齊墩果酸。 此外，通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖和流加H2O2的方式考察齊墩果酸羥基化的反應(yīng)機(jī)理，佐證了齊墩果酸羥基化反應(yīng)是單加氧酶催化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明從48 h起每日補(bǔ)加葡萄糖10 g/L能保證較高的轉(zhuǎn)化率；菌體培養(yǎng)96 h始流加H2O2，最終濃度達(dá)到5 mmol/L能夠大幅度提高轉(zhuǎn)化率。 此后，對(duì)Aspergillus ochraceus NG1203轉(zhuǎn)化齊墩果酸11α-羥基化工藝進(jìn)行研究。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)

4、和正交實(shí)驗(yàn)，確定了搖瓶最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g/L，玉米漿26 g/L，酵母膏3 g/L，K2HPO4 1.5 g/L。在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，發(fā)現(xiàn)加入有機(jī)溶劑和對(duì)羥化酶進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，可以提高底物的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)優(yōu)化操作條件得到：選擇乙醇作為有機(jī)溶劑，在反應(yīng)液中最終的濃度為3％(V/V)，加入2 mg/L的齊墩果酸作為誘導(dǎo)劑，24 h后，分批添加，齊墩果酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到13.24％。 最后，對(duì)水/有機(jī)相兩相體系羥基化齊墩果酸進(jìn)行

5、了初步研究：選擇乙酸丁酯作為兩相酶轉(zhuǎn)化體系中的有機(jī)相；采用響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)乙酸丁酯與水的體積比、齊墩果酸在乙酸丁酯中的濃度和搖床轉(zhuǎn)速三個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。得到以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)的擬合方程：ypred=27.52+0.61A-2.17A2+0.23B-2.75B2+1.19C-1.71C2根據(jù)模型得到兩相轉(zhuǎn)化法的優(yōu)化工藝條件為：乙酸丁酯與水體積比為1:1，齊墩果酸在乙酸丁酯中的濃度為2.0 g/L，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，得到齊墩果酸轉(zhuǎn)