卡那霉素致小鼠耳毒性的分子機(jī)制-耳蝸外毛細(xì)胞馬達(dá)蛋白Prestin的參與作用.pdf

1、目的：
　　 建立卡那霉素致小鼠耳毒性模型;明確小鼠耳毒性模型中,卡那霉素對(duì)耳蝸外毛細(xì)胞基底部外側(cè)膜上表達(dá)的馬達(dá)蛋白Prestin直接作用及其特點(diǎn);探討小鼠耳毒性模型中,卡那霉素耳毒性作用引起耳蝸內(nèi)組織細(xì)胞的凋亡、凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其發(fā)生特點(diǎn);探討卡那霉素所致的耳蝸內(nèi)細(xì)胞凋亡與Prestin蛋白表達(dá)及功能之間的關(guān)聯(lián);建立轉(zhuǎn)染Prestin基因的細(xì)胞株CHO-K1,在體外情況下,研究卡那霉素及細(xì)胞外的氯離子濃度對(duì)轉(zhuǎn)染Prestin

2、細(xì)胞的膜電位及細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度的影響,從而進(jìn)一步評(píng)估這些因素對(duì)Prestin功能的影響。
　　 方法：
　　 1、建立卡那霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生的BALB/c小鼠耳毒性模型。
　　 2、聽覺腦干反應(yīng)(ABR)的檢測(cè):采用tone-pip聲刺激,檢測(cè)小鼠耳毒性模型在不同刺激聲頻率上的聽覺閾值的變化,用以客觀評(píng)估卡那霉素給藥組與對(duì)照組的小鼠的聽覺功能變化及其二者間的差異;
　　 3、免疫組織化學(xué):應(yīng)用耳蝸石蠟切片與免

3、疫組織化學(xué)方法,探討耳毒性引起的耳蝸外毛細(xì)胞的損害與對(duì)Prestin蛋白的影響二者間的關(guān)聯(lián);耳蝸基底膜硬鋪片、原位免疫熒光染色、激光共聚焦顯微成像技術(shù)相結(jié)合,以觀察耳蝸外毛細(xì)胞馬達(dá)蛋白Prestin的表達(dá)與耳毒性之間的相關(guān)性;采用耳蝸石蠟切片、TUNEL與免疫組織化學(xué)方法,研究卡那霉素耳毒性過(guò)程中,耳蝸內(nèi)組織細(xì)胞的凋亡、凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及凋亡發(fā)生的特點(diǎn)。
　　 4、Real-timePCR檢測(cè):在卡那霉素不同用藥時(shí)間組的小鼠耳蝸

4、內(nèi),檢測(cè)Prestin蛋白的RNA表達(dá)量,以觀察卡那霉素在分子水平上對(duì)Prestin蛋白的作用;檢測(cè)不同用藥時(shí)間組的小鼠耳蝸內(nèi)miR-34a,miR-34c的表達(dá),研究二者是否參與了AmAn的耳毒性所導(dǎo)致的耳蝸內(nèi)組織細(xì)胞凋亡的調(diào)控過(guò)程。
　　 5、轉(zhuǎn)染Prestin-pcDNA3.1(-)的質(zhì)粒到細(xì)胞株CHO-K1,通過(guò)藥物篩選建立體外高表達(dá)Prestin蛋白的細(xì)胞株,并采用熒光探針染料標(biāo)記結(jié)合顯微熒光成像記錄技術(shù),研究卡那霉素

5、及細(xì)胞外的氯離子濃度對(duì)高表達(dá)Prestin蛋白的細(xì)胞膜電位與細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度的影響。通過(guò)卡那霉素體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡,觀察Prestin蛋白與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功建立卡那霉素致BALB/c小鼠耳毒性模型。
　　 2、在卡那霉素所致的小鼠耳毒性過(guò)程中,用藥組小鼠的各刺激聲頻率上的ABR閾值上移,與用藥時(shí)間呈正相關(guān)性,而對(duì)照組的ABR聽覺閾值則沒有明顯變化;用藥10天后,用藥組與對(duì)照

6、組間ABR聽覺閾值存在極顯著性差異;高頻率(≥24kHz)的ABR聽覺閾值較早(用藥7天后)發(fā)生改變,而低頻率(≤8kHz)的ABR聽覺閾值改變則相對(duì)較晚。
　　 3、耳蝸外毛細(xì)胞的損害程度與用藥時(shí)間之間具有正相關(guān)性;外毛細(xì)胞馬達(dá)蛋白Prestin的表達(dá)量及表達(dá)位置發(fā)生變化;Prestin蛋白的RNA表達(dá)量也受到卡那霉素耳毒性的影響,表達(dá)量減少,與用藥時(shí)間之間存在著負(fù)相關(guān)性。
　　 4、各用藥組的耳蝸石蠟切片TUNEL檢

7、測(cè),顯示耳蝸內(nèi)組織細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,且與用藥時(shí)間呈一定的正相關(guān)性。
　　 5、免疫組織化學(xué)檢測(cè)凋亡信號(hào)途徑,以Calpain介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)最為明顯,Calpain蛋白的表達(dá)與用藥時(shí)間呈一定的正相關(guān)性。
　　 6、Real-time PCR檢測(cè)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的miR-34a在耳蝸內(nèi)表達(dá)量與用藥劑量呈正相關(guān)性;而另一參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的小分子RNA-miR-34c的表達(dá)在用藥組與對(duì)照組之間比較無(wú)顯著性差異。
　　

8、 7、卡那霉素作用于轉(zhuǎn)染后高表達(dá)Prestin蛋白的CHO-K1細(xì)胞,能夠使細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度升高,細(xì)胞膜電位去極化;去除細(xì)胞外溶液的氯離子,也能夠使細(xì)胞膜電位去極化,細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度輕微升高;Prestin轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組之間比較,卡那霉素與去除細(xì)胞外的氯離子對(duì)細(xì)胞膜電位的影響無(wú)顯著差異性,去除細(xì)胞外的氯離子對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度的改變也無(wú)差異性,但卡那霉素升高細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度卻在兩組之間存在著極顯著性差異。
　　 8、卡那

9、霉素作用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可引起細(xì)胞的凋亡,與用藥時(shí)間呈正相關(guān)性;轉(zhuǎn)染Prestin的細(xì)胞的凋亡率明顯高于對(duì)照組。
　　 討論：
　　 我們的研究表明,在卡那霉素所致小鼠耳毒性模型中,模型小鼠的聽覺ABR閾值上移,高頻率閩值改變?cè)缬诘皖l率閾值改變,這是由于卡那霉素的耳蝸毒性損害是先從耳蝸基底部開始,并向耳蝸?lái)敳堪l(fā)展,而耳蝸基底部主要是對(duì)高頻聲敏感,耳蝸?lái)敳縿t是對(duì)低頻聲敏感,因此卡那霉素耳毒性損害先影響高頻段聽覺,后作用于低頻段

10、聽覺。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在卡那霉素的耳毒性過(guò)程中,外毛細(xì)胞及其它一些內(nèi)耳組織細(xì)胞發(fā)生了凋亡性死亡,Calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是其中一個(gè)重要的凋亡途徑,這可能是由于卡那霉素的耳毒性作用使得細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高,致Calpain蛋白過(guò)度激活,引起細(xì)胞骨架和細(xì)胞膜的崩潰,膜蛋白,各種激酶,磷酸酶以及轉(zhuǎn)錄因子都受到嚴(yán)重影響,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 研究已經(jīng)表明,細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度對(duì)于Prestin蛋白功能具有重要影響,細(xì)

11、胞內(nèi)的氯離子可以作為Prestin蛋白的“電壓感受器”,感受細(xì)胞膜電位變化,促進(jìn)Prestin蛋白的構(gòu)象改變。將細(xì)胞內(nèi)的氯離子完全去除后,Prestin蛋白的功能則全部喪失,由此可知,細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度的變化對(duì)于Prestin蛋白功能具有直接的影響。細(xì)胞膜電位的變化也對(duì)Prestin蛋白的功能至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞膜電位去極化時(shí)Prestin蛋白“收縮”,導(dǎo)致細(xì)胞“縮短”;反之當(dāng)細(xì)胞膜電位超極化時(shí),Prestin蛋白“伸長(zhǎng)”,細(xì)胞則伸長(zhǎng)。因此

12、通過(guò)觀察卡那霉素作用于高表達(dá)Prestin蛋白的細(xì)胞,細(xì)胞膜電位以及細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度的變化,以此間接地評(píng)估對(duì)Prestin蛋白功能的影響。除了研究卡那霉素對(duì)細(xì)胞的直接作用外,還通過(guò)改變細(xì)胞外的氯離子濃度,觀察對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜電位及細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,卡那霉素可以直接影響細(xì)胞膜電位,使細(xì)胞膜電位去極化,但作用在Prestin轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞之間沒有明顯差別,表明卡那霉素對(duì)細(xì)胞膜電位的影響是非特異性的

13、。這種作用可能是由于卡那霉素與細(xì)胞膜上的磷酸肌醇相結(jié)合后,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高,細(xì)胞去極化。
　　 因此我們認(rèn)為,AmAn的急性耳毒性作用很可能是由于它們引起外毛細(xì)胞的膜電位及細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度改變,直接或間接地導(dǎo)致外毛細(xì)胞膜上的Prestin蛋白的功能受到了影響,而這種急性耳毒性作用是快速、可逆的,隨著停藥后耳蝸內(nèi)的AmAn逐漸清除,外毛細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)和功能,受損的聽覺功能逐漸恢復(fù)。至于長(zhǎng)期應(yīng)用AmAn所引起的耳毒性作

14、用,則是由于激活了其它的損傷應(yīng)激機(jī)制,如細(xì)胞的凋亡,外毛細(xì)胞凋亡壞死,缺失,Prestin蛋白表達(dá)位置發(fā)生改變,表達(dá)量減少,功能受到嚴(yán)重影響,由此導(dǎo)致的聽覺功能是不可逆性的損害。
　　 綜上所述,在AmAn耳毒性作用過(guò)程中,最初在外毛細(xì)胞的損害出現(xiàn)之前,AmAn可能直接作用于Prestin蛋白,影響其功能,也可能通過(guò)作用于Prestin蛋白的RNA合成階段,從而影響調(diào)控Prestin蛋白的表達(dá)及功能,最終導(dǎo)致聽覺功能的下降,產(chǎn)生

15、AmAn的急性耳毒性作用,這個(gè)過(guò)程是快速的,可逆的,如能夠及時(shí)去除AmAn的作用,聽覺功能會(huì)逐漸恢復(fù);如果不能及時(shí)停止AmAn耳毒性作用,將導(dǎo)致外毛細(xì)胞凋亡、缺失,Prestin蛋白表達(dá)量嚴(yán)重減少,表達(dá)位置也發(fā)生改變,由此導(dǎo)致聽覺功能的永久性損害。這對(duì)于我們臨床預(yù)防和治療AmAn的耳毒性具有重要的參考價(jià)值。在臨床長(zhǎng)期應(yīng)用AmAn藥物時(shí),應(yīng)及時(shí)監(jiān)測(cè)患者的聽覺功能,并應(yīng)注意對(duì)早期耳毒性先引起高頻聽覺(12kHz至16kHz)損害進(jìn)行檢測(cè),發(fā)

16、現(xiàn)聽覺功能早期損害時(shí),應(yīng)及時(shí)調(diào)整用藥,或是停藥一段時(shí)間,待聽覺功能恢復(fù)后再繼續(xù)治療。
　　 結(jié)論：
　　 1、在動(dòng)物模型中,長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用卡那霉素可以引起慢性耳毒性作用,聽覺功能損害隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而加重,聽覺閾值升高,高頻聽覺功能較早受損。
　　 2、卡那霉素致小鼠耳毒性過(guò)程中,引起耳蝸內(nèi)細(xì)胞凋亡性死亡,且與用藥時(shí)間具有正相關(guān)性。
　　 3、在耳蝸內(nèi)細(xì)胞凋亡過(guò)程中,以Calpain(鈣調(diào)蛋白)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

17、途徑為主,Calpain蛋白表達(dá)上調(diào),且與用藥時(shí)間具有一定的正相關(guān)性。
　　 4、miR-34a參與了卡那霉素所致耳蝸內(nèi)細(xì)胞凋亡的調(diào)控,其表達(dá)量與用藥時(shí)間及細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。
　　 5、卡那霉素慢性耳毒性過(guò)程中,導(dǎo)致外毛細(xì)胞崩潰、死亡、缺失,引起Prestin蛋白的表達(dá)量減少,與用藥時(shí)間呈正相關(guān)性,Prestin蛋白的表達(dá)位置也發(fā)生改變;卡那霉素也可以直接地影響Prestin蛋白的RNA合成,隨著用藥時(shí)間的延

18、長(zhǎng),耳蝸Prestin蛋白的RNA含量逐漸減少,其改變明顯先于外毛細(xì)胞及prestin蛋白表達(dá)的形態(tài)學(xué)變化。
　　 6、在體外建立高表達(dá)Prestin蛋白的CHO-K1細(xì)胞株,研究顯示,卡那霉素與細(xì)胞外的氯離子濃度的改變都可以非特異性地影響細(xì)胞的膜電位,使細(xì)胞去極化;卡那霉素可以顯著性地升高轉(zhuǎn)染表達(dá)Prestin蛋白的細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度。細(xì)胞膜去極化及細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度的改變都會(huì)進(jìn)一步影響到膜上表達(dá)的Prestin蛋白的功能。<