17-DMAG體外誘導(dǎo)HSP70并保護卡那霉素引起的耳蝸毛細胞損傷.pdf

1、第一部分：耳蝸器官體外培養(yǎng)技術(shù)的建立
　　目的：
　　建立穩(wěn)定的新生小鼠耳蝸器官(Corti’s Organ)的體外培養(yǎng)方法以及耳蝸毛細胞(hair cells)的組織學(xué)檢查技術(shù)，為內(nèi)耳研究提供新的條件和模型。
　　方法：
　　在解剖顯微鏡下將出生后3-5天的小鼠基底膜完整的分離，用顯微剪分成底回、中回和頂回三個節(jié)段，利用培養(yǎng)液的表面張力使基底膜節(jié)段貼培養(yǎng)皿底壁平鋪培養(yǎng)。應(yīng)用熒光標記的鬼筆環(huán)肽特異性染色標記耳蝸毛

2、細胞的靜纖毛和表皮板，熒光顯微鏡觀察。
　　結(jié)果：
　　耳蝸器官經(jīng)過24小時離體培養(yǎng)后，貼壁良好，外周可見明顯新生的上皮細胞及成纖維細胞；經(jīng)過2-4天的離體培養(yǎng)后，外周新生細胞繼續(xù)增加，熒光顯微鏡觀察顯示毛細胞形態(tài)良好，纖毛排列整齊，成倒“V”字形。三排外毛細胞（OHC）和一排內(nèi)毛細胞（IHC）無缺失。表皮板連接緊密。內(nèi)毛細胞每100微米縱向長度細胞個數(shù)為頂回8.92±0.665；中回10.67±0.606；底回11.58±

3、0.585。外毛細胞每100微米縱向長度細胞個數(shù)為頂回32.42±1.429；中回36.00±1.414；底回45.25±1.725。
　　結(jié)論：
　　組織貼壁法體外培養(yǎng)小鼠耳蝸器官是一種理想的觀察和評估耳蝸毛細胞的實驗造模方法。
　　第二部分：17-DMAG及硫酸卡那霉素分別對體外培養(yǎng)的耳蝸毛細胞的作用
　　目的：
　　研究抗炎及抗腫瘤藥物格爾德霉素的衍生物17-DMAG（17-(Dimethylamin

4、oethylamino)-17-demethoxygeldanamycin）及硫酸卡那霉素兩種藥物對體外培養(yǎng)的耳蝸毛細胞的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)新生小鼠耳蝸器官24小時后加入不同劑量的上述兩種藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，組織固定。用熒光標記的鬼筆環(huán)肽特異性染色標記耳蝸毛細胞的靜纖毛，熒光顯微鏡觀察。計數(shù)存活的毛細胞個數(shù)。
　　結(jié)果：
　　0.5μM，1μM，2μM及5μM濃度的17-DMAG對耳蝸毛細胞均

5、沒有明顯的毒性作用。0.2 mM，0.4 mM，和1.0 mM的卡那霉素對毛細胞均有不同程度的損傷，隨著卡那霉素濃度升高，毛細胞的損傷逐漸增加。外毛細胞的損傷程度大于內(nèi)毛細胞。底回毛細胞損傷最嚴重，中回次之，頂回毛細胞損傷較輕。
　　結(jié)論：
　　本實驗利用體外培養(yǎng)的耳蝸器官研究上述兩種物質(zhì)分別對耳蝸毛細胞的作用，易于精確控制劑量，簡單明確。本實驗排除了17-DMAG對耳蝸毛細胞的毒性作用。且對進一步研究毛細胞的保護作用提供了

6、藥物劑量。
　　第三部分：17-DMAG誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的耳蝸毛細胞過表達HSP70蛋白并保護卡那霉素引起的毛細胞損傷
　　目的：
　　研究17-DMAG在體外培養(yǎng)的耳蝸毛細胞是否可以誘導(dǎo)HSP70過表達并保護卡那霉素引起的耳蝸毛細胞損傷。
　　方法：
　　選取2μM17-DMAG濃度，分為給藥組和空白對照組。利用漂浮培養(yǎng)法獲得足夠量的基底膜組織。利用實時定量PCR法和ELISA法檢測2.5小時、5小時、10小

7、時，以及24小時后HSP70在核酸和蛋白水平的表達量。利用熒光免疫組織化學(xué)法檢測HSP70在基底膜的表達部位。選取2μM17-DMAG濃度和0.4 mM卡那霉素濃度。分為空白對照組，卡那霉素組，和17-DMAG+卡那霉素組。利用鬼筆環(huán)肽特異性染色標記耳蝸毛細胞的靜纖毛，熒光顯微鏡觀察。計數(shù)存活的毛細胞數(shù)量。
　　結(jié)果：
　　17-DMAG在體外培養(yǎng)的耳蝸毛細胞可以誘導(dǎo)HSP70過表達，蛋白質(zhì)水平的表達增加晚于核酸水平，但維持