卡那霉素對乙酰膽堿調節(jié)耳蝸外毛細胞的影響.pdf

1、中國醫(yī)科大學碩士學位論文卡那霉素對乙酰膽堿調節(jié)耳蝸外毛細胞的影響姓名：高青華申請學位級別：碩士專業(yè)：生理學指導教師：湯浩20090401強度由95dBSPL開始，按5dBSPL逐檔遞減，聽閾判斷以ABR的P3波為準。3、耳蝸基底膜鋪片硝酸銀染色檢測外毛細胞將各組豚鼠斷頭取聽泡，暴露耳蝸，從蝸尖向蝸內輕輕推注05％的AgN03溶液5ml，置于05％AgN03溶液中15min，蒸餾水漂洗，用4％多聚甲醛溶液固定4h以上，同時在日光下曝光11

2、5h，然后在解剖顯微鏡下分離基底膜，置于載玻片上，用甘油蓋玻片封片鏡檢，觀察各組外毛細胞分布及形態(tài)學特點。4、免疫組化檢測耳蝸乙酰膽堿酯酶(acetyrlcholinesterase，ACHE)表達各組豚鼠停藥并測試完ABR后，立即斷頭處死，速取聽泡，經(jīng)固定、脫鈣后行石蠟包埋，平行蝸軸連續(xù)切片，將各組切片進行AChE免疫組織化學染色，陰性對照組用PBS代替一抗，其他不變。檢測時，將切片置于顯微鏡下，每張切片均取柯蒂氏器作為視野，數(shù)碼相機

3、拍照，用顯微圖像分析系統(tǒng)測定各組AChE陽性反應的平均灰度值。灰度值越小，表示陽性反應越強。5、外毛細胞的急性分離將豚鼠迅速斷頭處死，取出兩側聽泡，在人工外淋巴液中打開聽泡，剔除耳蝸骨殼，切下二至頂轉耳蝸，放入含有025％胰蛋白酶的無鈣人I#b淋巴液中，溫度為2025℃，消化lOmin棄去酶液，人工外淋巴液反復沖洗三次以終止消化。用細口徑吸管反復吹打至細胞離散，將OHC懸液放人冰箱(4℃)或置室溫保存。6、熒光測鈣選擇分離活性好的OHC

4、，按以下分組進行實驗：①對照組、②Ach組、③ACh卡那霉素組。OHC懸液中加入Fluo一3／AM避光孵育30min，用顯微熒光測鈣系統(tǒng)檢鋇lJFluo3熒光強度的變化。熒光圖象記錄于計算機中，用配套軟件分析熒光強度變化，熒光強度表示游離鈣濃度的高低。7、統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)標準差(x壇)表示，用excel軟件進行f檢驗。結果1、ABR閾值檢測用藥前各組豚gABR閾值無顯著性差異(胗O05)；用藥后卡那霉素給藥3天組ABR閾值無明