異氟醚對(duì)大鼠耳蝸和豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、對(duì)于全身麻醉來(lái)說(shuō)，麻醉藥物作用部位是從脊髓到大腦皮層這一段廣闊的區(qū)域，包括傳入神經(jīng)、傳出神經(jīng)、神經(jīng)中樞的多種神經(jīng)元。研究表明全麻藥物對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)中外周傷害性感受器、神經(jīng)軸傳導(dǎo)幾乎沒(méi)有任何作用，但現(xiàn)已證實(shí)對(duì)神經(jīng)突觸有明顯作用，如多數(shù)吸入全麻藥可對(duì)興奮性突觸傳遞產(chǎn)生抑制，而抑制性突觸傳遞產(chǎn)生增強(qiáng)作用。聽(tīng)覺(jué)的傳導(dǎo)路徑比較復(fù)雜，聲波傳入內(nèi)耳，刺激耳蝸螺旋器，使耳蝸毛細(xì)胞興奮，并以神經(jīng)沖動(dòng)形式經(jīng)聽(tīng)神經(jīng)傳向大腦皮層聽(tīng)覺(jué)中樞(auditory ce

2、nter)，產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)。聽(tīng)覺(jué)是全身麻醉中最后消失的一個(gè)感覺(jué)，也是清醒時(shí)恢復(fù)的第一感覺(jué)；視覺(jué)和本體感覺(jué)等很容易被全麻藥物所抑制，而聽(tīng)覺(jué)在麻醉中并不是突然消失的，隨著麻醉程度的加深逐漸被抑制。在全身麻醉中聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)除了聽(tīng)皮層、聽(tīng)性腦干受到抑制外，全麻藥物對(duì)外周感受器耳蝸的作用至今仍不清楚。
　　 目前關(guān)于全麻后聽(tīng)力損害的報(bào)道越來(lái)越多，發(fā)生機(jī)制不清楚。那么全麻藥物是否與耳毒性藥物(如鏈霉素、順鉑、水楊酸鈉等)一樣，可以使耳蝸基因表達(dá)發(fā)生變

3、化，進(jìn)而形態(tài)學(xué)發(fā)生病理學(xué)改變導(dǎo)致耳損害？
　　 基于以上兩點(diǎn)原因，本研究通過(guò)觀察異氟醚和氧化亞氮對(duì)大鼠耳蝸總RNA的影響、異氟醚對(duì)大鼠耳蝸一氧化氮合酶活性的影響，以及對(duì)異氟醚豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的影響，初步了解吸入麻醉藥對(duì)耳蝸的作用機(jī)制。
　　 本課題共分三部分：
　　 第一部分
　　 目的：通過(guò)檢測(cè)吸入麻醉藥異氟醚(Isoflurane)、氧化亞氮(N2O)對(duì)大鼠耳蝸總RNA含量的影響,探討

4、異氟醚、氧化亞氮對(duì)大鼠內(nèi)耳有無(wú)損害作用以及耳損害的可能機(jī)制。
　　 方法：30 只健康Wistar大鼠隨機(jī)等分為三組：C組(對(duì)照組，n=10)持續(xù)吸入50[％]氧氣(O2) 3小時(shí)；N組(實(shí)驗(yàn)組，n=10)持續(xù)吸入50[％] N2O+50[％] O2 3小時(shí)；I組(實(shí)驗(yàn)組，n=10)持續(xù)吸入2.5[％] 異氟醚3小時(shí)。然后將所有大鼠斷頭處死,取出雙側(cè)聽(tīng)泡,剝離耳蝸,各組標(biāo)本編號(hào)記錄后分開(kāi)液氮低溫保存。聯(lián)用TRIzol和Rneas

5、y法分別抽取三組大鼠耳蝸的總RNA,用分光光度法測(cè)總RNA的含量及電泳檢測(cè)其質(zhì)量。
　　 結(jié)果：檢測(cè)C組大鼠耳蝸得到總RNA含量7.69μg；N組大鼠耳蝸得到總RNA含量6.51μg，與C組相比減少15[％]；I組大鼠耳蝸得到總RNA含量7.32μg，與C組相比幾乎沒(méi)變化。C組、N組和I組的A260/A280值分別為2.07、2.04和2.04,提示RNA純度高；電泳結(jié)果提示總RNA無(wú)降解。
　　 結(jié)論：吸入氧化亞氮的大

6、鼠耳蝸總RNA 較正常大鼠耳蝸總RNA 含量降低,而吸入異氟醚的大鼠耳蝸總RNA 含量無(wú)明顯變化。提示氧化亞氮干擾耳蝸RNA 含量，使大鼠耳蝸基因表達(dá)發(fā)生變化可能是造成耳損害的原因之一，而異氟醚對(duì)耳蝸RNA 含量沒(méi)有明顯影響。
　　 第二部分
　　 目的：通過(guò)觀察不同濃度的吸入麻醉藥異氟醚(Isoflurane)對(duì)大鼠耳蝸Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)各型NOS(nitric oxide synthase)活性的影響

7、,探討吸入麻醉藥對(duì)大鼠聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)外周感受器的可能作用機(jī)制。
　　 方法：30只健康Wistar大鼠隨機(jī)等分為三組：C組(對(duì)照組，n=10)持續(xù)吸入O2 30分鐘；I1組(實(shí)驗(yàn)組，n=10)持續(xù)吸入1.5[％]異氟醚+O2 30分鐘；I2組(實(shí)驗(yàn)組，n=10)持續(xù)吸入3.0[％]異氟醚+O2 30分鐘。待各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間完成后，立即斷頭處死，迅速取出聽(tīng)泡。充分暴露耳蝸后，在解剖顯微鏡下刺破蝸窗及前庭窗，蝸尖鉆孔并緩慢注入含4[％]多

8、聚甲醛固定，脫鈣后標(biāo)本制作石蠟切片。HE染色觀察各組大鼠耳蝸組織學(xué)改變；用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠耳蝸Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)誘生型NOS(iNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)、神經(jīng)元型NOS(nNOS)的表達(dá)，采用Motic image advance圖像分析儀，分別測(cè)量各組大鼠耳蝸組織不同部位NOS平均灰度值；灰度值越小，表示陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)。以觀察不同濃度異氟醚麻醉對(duì)大鼠耳蝸NOS活性的影響。
　　 結(jié)果：HE染

9、色觀察各組大鼠耳蝸Corti器毛細(xì)胞無(wú)損傷，血管紋清晰，螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)構(gòu)正常。C組大鼠耳蝸Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)各型NOS均有強(qiáng)弱不等的陽(yáng)性表達(dá)；與C組比較，I1組大鼠耳蝸Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)各型NOS陽(yáng)性表達(dá)均有減弱、各型NOS平均灰度值均有升高趨勢(shì)，除血管紋iNOS外其余均有顯著性差異(P<0.05)；與C組比較，I2組大鼠耳蝸Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)各型NOS陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)一步減弱、各型NOS平均灰度

10、值升高明顯(P<0.05)，其中以螺旋神經(jīng)節(jié)各型NOS平均灰度值升高顯著(P<0.01)；與I1組比較，I2組大鼠耳蝸Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)各型NOS陽(yáng)性表達(dá)減弱、各型NOS平均灰度值升高趨勢(shì),但除螺旋神經(jīng)節(jié)中eNOS、nNOS外其余均沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：吸入異氟醚麻醉大鼠耳蝸NOS活性較正常大鼠耳蝸降低,且耳蝸NOS活性降低程度與吸入異氟醚濃度呈正相關(guān)。推測(cè)異氟醚可抑止耳蝸Corti器、血

11、管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)NOS活性，減少NO(nitric oxide)產(chǎn)生，從而抑止聽(tīng)覺(jué)外周感受器功能。
　　 第三部分
　　 目的：觀察不同濃度異氟醚對(duì)氯化鉀和咖啡因誘發(fā)的豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞內(nèi)鈣離子移動(dòng)的影響，探討其對(duì)聽(tīng)覺(jué)外周感受器(耳蝸)作用的可能機(jī)制。
　　 方法：采用酶孵育后機(jī)械分離法急性分離豚鼠耳蝸外毛細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察外毛細(xì)胞的形態(tài),辨認(rèn)其活性。用Fluo-3AM 熒光指示劑染色活性良好的豚鼠耳蝸外

12、毛細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察使用異氟醚預(yù)處理前及不同濃度異氟醚即1.0 最低肺泡有效濃度(minimal alveolar concentration,MAC)、2.0MAC 預(yù)處理后，用氯化鉀和咖啡因誘發(fā)的耳蝸外毛細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度的變化，記錄5min 熒光強(qiáng)度峰值；并用激光共聚焦圖形分析軟件Profile 功能測(cè)各細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析，從而了解異氟醚預(yù)處理前、后對(duì)氯化鉀和咖啡因誘發(fā)的耳蝸外毛細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化的影響。<