耳蝸外毛細(xì)胞動(dòng)力蛋白對(duì)聽(tīng)覺(jué)靈敏度與頻率響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、隨著聾病機(jī)制研究的快速發(fā)展，對(duì)耳蝸主動(dòng)放大機(jī)制的探索成為理解耳聾病發(fā)生機(jī)制的最關(guān)鍵的一環(huán)。以Prestin(Motor Protein，動(dòng)力蛋白)為分子基礎(chǔ)的外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)(Electromotility)則是耳蝸主動(dòng)放大機(jī)制形成的必要條件。1985年Brownell發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞長(zhǎng)度能隨電位的變化快速改變的外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)。外毛細(xì)胞這種獨(dú)一無(wú)二的外電運(yùn)動(dòng)的頻率高達(dá)110kHz，且不直接依賴于ATP與鈣離子的濃度，能夠?qū)β暡ㄒ鸬亩伝啄さ?/p>

2、振動(dòng)進(jìn)行放大和修飾，從而大大提高了內(nèi)耳敏感性和頻率選擇性。細(xì)胞膜低通濾波特性與高頻電運(yùn)動(dòng)之間的差異提示，外毛細(xì)胞壓電反應(yīng)(Piezoelectricity)在耳蝸機(jī)電轉(zhuǎn)換過(guò)程可能具有重要作用。2000年發(fā)現(xiàn)了編碼膜動(dòng)力蛋白(Prestin)的基因Pres，隨后的工作證實(shí)了Prestin蛋白是外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)及壓電反應(yīng)所必須的分子基礎(chǔ)。自Prestin蛋白發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其在聽(tīng)覺(jué)調(diào)控機(jī)制中的作用及基本特性一直就是聽(tīng)覺(jué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。受各種因素的

3、制約，目前尚缺乏Prestin的在外毛細(xì)胞側(cè)膜中的存在形式、位置及更新機(jī)制的直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。雖有藥物調(diào)控外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)的報(bào)道，但未見(jiàn)Prestin的表達(dá)能否被調(diào)控的報(bào)道。為了探索Prestin及對(duì)聽(tīng)覺(jué)的調(diào)控機(jī)理，本研究試以Prestin蛋白在外毛細(xì)胞膜上的表達(dá)更新為切入點(diǎn)，綜合利用病理生理等技術(shù)方法，對(duì)外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)的調(diào)控機(jī)制及壓電反應(yīng)的意義進(jìn)行初步研究，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果從提高聽(tīng)覺(jué)靈敏度與頻率選擇性的角度對(duì)Prestin蛋白及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制

4、進(jìn)行分析討論。
　　 第一部分耳蝸外毛細(xì)胞基底細(xì)胞膜Prestin蛋白分布與表達(dá)的研究
　　 目的：本研究以明確OHC基底細(xì)胞膜上是否存在Prestin的表達(dá)及其在側(cè)膜三層結(jié)構(gòu)中的定位為目標(biāo)，對(duì)Prestin蛋白的功能及可能的更新機(jī)制進(jìn)行了探索。Prestin是外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)的分子基礎(chǔ)，特異性地表達(dá)在OHC側(cè)膜上，在胞漿、表皮板及纖毛上無(wú)表達(dá)。以往工作雖在外毛細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)有高密度的蛋白顆粒分布，但未能確定這些蛋白顆粒與P

5、resin蛋白之間的關(guān)系及在基底細(xì)胞膜上的有無(wú)分布。
　　 方法：在本研究中，分別取正常小鼠、大鼠及豚鼠耳蝸的單離外毛細(xì)胞及全基底膜，在激光共聚焦顯微鏡下，利用Prestin特異性抗體與細(xì)胞膜標(biāo)記di-8-ANEPPS雙染，對(duì)Prestin在兩種標(biāo)本上的表達(dá)與分布情況進(jìn)行了觀察。
　　 結(jié)果：(1)不僅OHC基底側(cè)膜上存在Prestin抗體的陽(yáng)性染色，OHC底端細(xì)胞膜上亦見(jiàn)陽(yáng)性染色，但其熒光強(qiáng)度僅為側(cè)膜的80.5％和61

6、.1％；(2)與細(xì)胞膜標(biāo)記di-8-ANEPPS染色相比，Prestin抗體的陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜的外側(cè)；經(jīng)低滲細(xì)胞外液處理后，OHC側(cè)膜中的質(zhì)膜層可與SSL和CL分離，在激光共聚焦顯微鏡下，外毛細(xì)胞膜最外側(cè)的質(zhì)膜層上可見(jiàn)明顯的Prestin抗體陽(yáng)性染色。
　　 結(jié)論：通過(guò)對(duì)本研究結(jié)果的分析，我們認(rèn)為Prestin分布于外毛細(xì)胞膜中最外側(cè)的質(zhì)膜層上，在細(xì)胞基底部細(xì)胞膜上亦有表達(dá)。
　　 第二部分 Prestin蛋白表達(dá)的功

7、能性調(diào)控
　　 目的：急性使用水楊酸鈉能夠可逆性的抑制外毛細(xì)胞的電運(yùn)動(dòng)并引起聽(tīng)力下降，但長(zhǎng)期服用水楊酸鈉可使畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射幅值增大。因Prestin是外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力蛋白，明確長(zhǎng)期服用水楊酸鈉對(duì)Prestin表達(dá)及對(duì)外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)有無(wú)直接影響，并提示耳蝸放大機(jī)制有著重要意義。
　　 方法：本部分中將按照經(jīng)典的耳鳴建模方法，使用水楊酸鈉建立動(dòng)物模型。在記錄耳聲發(fā)射及外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR及West

8、ern blot等方法，在RNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞以及整體動(dòng)物等多個(gè)水平上，探索Prestin表達(dá)與耳蝸功能之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：長(zhǎng)期服用水楊酸鈉不僅增大了畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射幅值，也明顯提高了Prestin的表達(dá)與外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)能力。在mRNA與蛋白水平，長(zhǎng)期服用水楊酸鈉使Prestin蛋白表達(dá)量增大至正常水平的3～4倍。外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)的充電密度提高了18％。此類變化是可逆性，停止服用水楊酸鈉后Prestin的表達(dá)與外毛細(xì)

9、胞電運(yùn)動(dòng)則恢復(fù)至正常值。本研究從病理生理的角度證明了Prestin對(duì)聽(tīng)覺(jué)靈敏度及頻率選擇性的調(diào)控作用。值得注意的是，在這一過(guò)程中雖然環(huán)氧合酶(Cox)II的表達(dá)不受影響，但是NF-KB的表達(dá)被抑制，而核轉(zhuǎn)錄因子c-fos和egr-1的表達(dá)則被上調(diào)。
　　 結(jié)論：在體狀態(tài)下長(zhǎng)期注射水楊酸鈉后隨著耳蝸功能的增強(qiáng)，Prestin蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)上調(diào)。Cox-II依賴性通路對(duì)調(diào)控Prestin表達(dá)有重要作用。
　　 第三部分 Pre

10、stin蛋白壓電效應(yīng)提高外毛細(xì)胞的高頻響應(yīng)
　　 目的：聽(tīng)覺(jué)換能過(guò)程中，哺乳動(dòng)物活體耳蝸外毛細(xì)胞在產(chǎn)生感覺(jué)器電位的同時(shí)亦承受因基底膜振動(dòng)所帶來(lái)的機(jī)械刺激。在外力刺激下，耳蝸外毛細(xì)胞基于Prestin產(chǎn)生電運(yùn)動(dòng)的同時(shí)還具有壓電反應(yīng)，并通過(guò)調(diào)控基底膜的行波來(lái)有效提高聽(tīng)覺(jué)敏感度與頻率選擇性，這是耳蝸主動(dòng)放大機(jī)制最重要的生理基礎(chǔ)。電壓依賴性的外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)可被跨膜電位驅(qū)動(dòng)。但通常細(xì)胞膜因膜電容的存在而成為一個(gè)截止頻率為1kHz左右的低通

11、濾波器，盡管電運(yùn)動(dòng)的分子基礎(chǔ)—Prestin蛋白構(gòu)型改變的頻率高達(dá)100kHz，但其驅(qū)動(dòng)力—跨膜電位的高頻部分可被低通濾波器大幅度衰減。根據(jù)機(jī)械性牽拉或壓縮外毛細(xì)胞能夠引起細(xì)胞膜電位變化并有相應(yīng)壓電電流產(chǎn)生的現(xiàn)象，雖推測(cè)壓電反應(yīng)可能是其克服高頻衰減的能量來(lái)源，但尚缺乏直接地實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 方法：將利用全細(xì)胞膜片鉗記錄外毛細(xì)胞壓電反應(yīng)的方法，在不同條件下給予外毛細(xì)胞不同頻率的機(jī)械刺激來(lái)記錄外毛細(xì)胞的壓電反應(yīng)，并通過(guò)與模擬電路以及

12、支持細(xì)胞高頻響應(yīng)的比較，來(lái)驗(yàn)證Prestin蛋白壓電效應(yīng)是否能夠提高外毛細(xì)胞的高頻響應(yīng)。本部分工作將利用全細(xì)胞膜片鉗記錄外毛細(xì)胞壓電反應(yīng)的方法，在不同條件下給予外毛細(xì)胞不同頻率的機(jī)械刺激來(lái)記錄外毛細(xì)胞的壓電反應(yīng)，并通過(guò)與模擬電路以及支持細(xì)胞高頻響應(yīng)的比較，來(lái)驗(yàn)證Prestin蛋白壓電效應(yīng)是否能夠提高外毛細(xì)胞的高頻響應(yīng)。
　　 結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)外毛細(xì)胞壓電效應(yīng)的存在使得外毛細(xì)胞的高頻頻響顯著增大，并將截止頻率擴(kuò)展至70-90kHz

13、。實(shí)驗(yàn)中采用全細(xì)胞膜片鉗可在外毛細(xì)胞上記錄到高達(dá)80kHz的頻響平臺(tái)。當(dāng)去除壓電效應(yīng)后外毛細(xì)胞對(duì)單純電刺激的反應(yīng)呈低通特性，截止頻率僅為lkHz左右，這與其它組織細(xì)胞相類似。
　　 結(jié)論：本研究結(jié)果證實(shí)在耳蝸主動(dòng)放大機(jī)制中外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)可增大高頻響應(yīng)并有效擴(kuò)展哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)頻率范圍。
　　 第四部分耳蝸Deiters細(xì)胞及縫隙連接對(duì)外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)的調(diào)控
　　 目的：哺乳動(dòng)物的聽(tīng)覺(jué)器官對(duì)聲音具有高靈敏和極精細(xì)的分辨

14、能力，以外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)為特征的耳蝸主動(dòng)放大機(jī)制是其重要的基礎(chǔ)。耳蝸外毛細(xì)胞處于支持細(xì)胞，特別是Deiters細(xì)胞(Deiters cell，DC)的支撐和環(huán)繞之中。Deiters細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)的指突與外毛細(xì)胞頂部的表皮板相連，寬大的胞體與外毛細(xì)胞底部相連接構(gòu)成穩(wěn)定的弓形結(jié)構(gòu)以支撐Cortis器的外部形態(tài)。Deiters細(xì)胞與外毛細(xì)胞之間雖有組織連接，但以往并未觀察到兩者之間存在直接電導(dǎo)聯(lián)的證據(jù)。
　　 方法：利用雙膜片鉗技術(shù)在單離的外

15、毛細(xì)胞—Deiters細(xì)胞對(duì)上，對(duì)Deiters細(xì)胞及細(xì)胞間的縫隙連接通道耦合對(duì)外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)影響進(jìn)行觀察。
　　 結(jié)果：當(dāng)給予Deiters細(xì)胞適當(dāng)?shù)碾妷夯螂娏鞔碳r(shí)能夠直接影響外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。Deiters細(xì)胞去極化時(shí)能夠降低與外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)的NLC及頻率響應(yīng)。當(dāng)Deiters細(xì)胞與外毛細(xì)胞間的機(jī)械耦合或Deiters細(xì)胞的細(xì)胞骨架被破壞后，Deiters細(xì)胞對(duì)非線性電容的影響消失。同時(shí)我們觀察到Deiters細(xì)

16、胞間的縫隙連接(Gap junction，GJ)被破壞后可使膜電位及NLC的電壓依賴特性發(fā)生改變。另外與外毛細(xì)胞連接在一起的Deiters細(xì)胞可以提高ATP對(duì)外毛細(xì)胞電運(yùn)動(dòng)調(diào)控的效能。
　　 結(jié)論：Deiters細(xì)胞能夠通過(guò)細(xì)胞骨架或改變細(xì)胞膜的張力來(lái)直接影響外毛細(xì)胞的電運(yùn)動(dòng)。Deiters細(xì)胞間的縫隙連接對(duì)外毛細(xì)胞狀態(tài)有著直接的調(diào)控作用。上述研究結(jié)果將為我們更深入地理解聽(tīng)器精細(xì)調(diào)控及縫隙連接在內(nèi)耳中的功能提供新的思路。